Tesis composion quimica_de_veneno_de_abeja[1]

Universidad de Los Andes
Facultad de Farmacia y
Escuela de Bioanálisis.
Dpto. de Toxicología y
Farmacología
COMPARACIÓN DE LA COMPOSICIÓN
QUÍMICA DE LOS VENENOS DE ABEJAS
(Apis mellifera) DE VENEZUELA Y
BRASIL.
Proyecto de Investigación
Bioanálisis.
Jaimes. C., Fraida J.
Rangel. V., Eudysmar.
Tutor: Prof. Carlos
Yánez
Mérida, Julio 2009

Grupo más
grande
Reino
Animal
LLAASS
AABBEEJJAASS
Los
Insectos
REIN
O
Constituyen
Dentro del
cual
Se clasifican Taxonómicamente
en:
ESPECI
E
GENER
O
ORDE FAMILIA
N
CLAS
E
PHYLU
M
Animal
ia
mellife
ra
Hymenópte Apidae Apis
ra
Insect
a
Arthropo
da
Insectos
venenosos
HHyymmeennóóppttee
rraa
Insectos con
Alas
Membranosas
Grupo
Con características
como:
Organizació
n Social
Beneficios
al
Ecosistema
Beneficios
Económico
s
Animales venenosos
de mayor
importancia
Debido
Alta
MORTALIDAD
de sus
Picaduras
APOCRIT
A
SYMPHYT
A
Se dividen
en:
Carecen
de
Aguijón
Hábitos Alimenticios
Variados
PARASITOI
DES
NÉCTA
R
Posee
n
aguijó
n
DEPREDAD
ORAS

AASSPPEECCTTOOSS GGEENNEERRAALLEESS
LLAASS
Insecto (AAABpBis EEmelJJlifAAeraSS)
Social
Hembras de la
SeC doifelorennicaian
en
Reinas
Fértiles
Trabajado
ras
EnEcsatrgéardilaess de:
VIGILANCI
A
BÚSQUEDA
DE
ALIMENTOS
Marcadas por la
edad
Esta dotado
de
CARACTERÍST
ICAS
Permiten la
adaptación
Diferentes
Zonas
Climáticas
a
Dando origen
DIFERENTES
ESPECIES DE
ABEJAS
a

VVEENNEENN
OO
VENENO = APITOXINA
Mezcla
Complej
a
Sustanci
a Toxica
Incluye
Bajo Peso
Molecular
Alto Peso
Molecular
Reaccione
s
Alérgicas
Debido
a
Compuest
os
Orgánicos
Acción de
las
Enzimas
que posee
Producto
Generad
o
Interior del
abdomen
Que produce en
los individuos
Animale Hombre
s
Posee
Cantidad y
proporciones
de los
componentes
Varían Entre un
especie y
otra
Efectos que pueden variar por
Edad
Flores
Frecuenta
das

APARATO
CPoImCpuAeDstoO pRor:
Glándula
de
Veneno
Canal
Inoculado
r
Ácida
Alcalina
Conformado
por
Aguijón
Quitinos
o
Dos lancetas
latero-inferiores
Estilete
Dorsal
Profundas
de
Introducirse
Difícil de
Retirar
Asociada
al
Deslizables hacia
atrás y hacia delante
Ubicado en
un
conducto Del cual protruye en
estado de Reposo
Punta
Aguzada
De la Victima

Sistema
Sufre adaptaciones y
modificaciones
fisiológicas
En las
ESTRUCTU
RAS
Externa
s
Internas
Partes del
Aparato
Ovopositor
Partes del
Aparato
Transformándose Reproductivo
así
Los Ovarios,
Glándulas Accesorias
y Ductos
En órganos
que:
PRODUC
EN
ALMACEN
AN
CONDUCE
N
AAPPAARRAATTOO
PPIICCAADDOORR
Aparato
Inoculador
del veneno
La
toxina
EL VENENO Como
Respuesta:
DEFENSI
VA
DOMINANCI
A
De la
colmena
De la
misma
abeja
Entre Reinas

CARACTERÍSTICAS
FISICOQUÍMICAS
•Liquido acuoso.
•Aproximadamente 88% de agua.
•Transparente.
•Sabor amargo y acido (pH 4,5 a
5,5).
•Densidad mayor a la del agua.
•Hidro y Acido Soluble.
•Insoluble en alcohol.
•Color crema (deshidratado).

COMPONENTES DEL
VENENO
FOSFOLIPAS
A A2
HIALURONI
DASA
FOSFATASA
ACIDA
PROTEÍ
NAS
SEROTONI
NA
MELITI
NA
APAMIN
A
PÉPTIDO
DEGRANULADOR DE
MASTOCITOS
PÉPTID
OS
CATECOLAMI
NAS
HISTAMI
NA
AMINAS
TERTIAP
INA
SECAPARI
NA
OTROS
COMPOSICIÓN
QUÍMICA DEL
VENENO

PROTEÍNAS
FOSFOLIPAS
A A2
Característic
as
Moleculares
10-12 % del peso
seco del veneno
Acción en el
Organismo
Enzima Extracelular
Actúa
Sinérgicamente
MELITINA
FIBRAS POSGANGLIONARES
Sistema Nervioso Autónomo Periférico
14 KDa Provocando
Aumento en
la Liberación
Aumento en
la
Recaptacion
ACETILCOLIN
A
Observándo
se
disminución
Frecuencia
Peso Molecular
Inicio de
Potencial
PLACA
MOTORA
Sobr
e

PROTEÍNAS
FOSFOLIPAS
A A2
Característic
as
Moleculares
10-12 % del peso
seco del veneno
Acción en el
Organismo
Enzima Extracelular
Peso Molecular
14 KDa
HIDROLISA
Fosfatidilcolina
Fosfatidiletanolamin
a
Fosfatidilserina
Originando
DESTRUCCION DE
LA MEMBRANA
Hemólisis
Lesión
Tisular
Formándose
ISOLECITINA
De las
células
Cebadas
Liberando
HISTAMINA

PROTEÍNAS
HIALURONID
ASA
Característic
as
Moleculares
Acción en el
Organismo
Conformada por
350 residuos de
aa.
Peso Molecular
50 KDa
Cataliza la
Despolimerizació
n
ÁCIDO HIALURÓNICO
Actuando
como Factor de
Difusión
Aumentando la
permeabilidad capilar
Esparcimiento del
Veneno
A los tejidos
Por degradación de
los polímeros
ÁCIDO
ARAQUIDONICO
Intracelular

PROTEINAS
FOSFATASA
ÁCIDA
Característic
as
Moleculares
Acción en el
Organismo

PEPTIDOS
MELITINA
Característic
as
Moleculares
Acción en el
Organismo
Pequeño de 26
residuos de aa.
Peso Molecular
2,84 KDa
Péptido Antipático
Representa el 50%
de las proteínas
totales del veneno
Mejora la Actividad
FOSFOLIPASA A2
Actuando
Coadyuvante pcoamrao
la presencia de
Calcio
Actividad
Enzimátic
a
MELITI
NA
Necrotizante
Posee
Acción
Citolítica
Sobre Diferentes
Tipos Celulares
Mecanismos no
Enzimáticos
mediante

PEPTIDOS
MELITINA
Característic
as
Moleculares
Representa el 50%
de las proteínas
totales del veneno
Acción en el
Organismo Péptido Antipático
Pequeño de 26
residuos de aa.
Peso Molecular
2,84 KDa
Se une
a
Membrana
Plasmática
Desorganizando
Lípidos Proteínas
Aumentando la
Permeabilidad
Cambios en la induciendo
composición iónica
Muerte Celular

PEPTIDOS
APAMINA
Característic
as
Moleculares
Representa el 2% del
total del veneno
Acción en el
Organismo
Pequeño de 18
residuos de aa.
Peso Molecular
2,034 KDa
Hiperactividad
efecto
s
Tiende a
Desencadenar
Efectos
Cardioestimulantes
Tener
Propiedades
Antiarritmicas
APAMIN
A
Aumentando los
reflejos Polisinápticos
Profundos
Intensos
Medula
Espinal
Sobre
Espasmos
Musculares
Excitación de las
vías
Polisinápticas
Provocand
o

PEPTIDOS
Característic
as
Moleculares
Acción en el
Organismo
Pequeño de 18
residuos de aa.
Peso Molecular
2,034 KDa
APAMINA Representa el 2% del
total del veneno
Actúa
Sinérgicamente
FOSFOLIPASA A2
Aumentando
Niveles de Cortisol
Plasmático
APAMIN
A
Inhibe los
canales de
Calcio
Conductancia
del Potasio
Actividad
Farmacológica
Sistema
Nervioso
Central
Dependientes
Mas notable
en

PEPTIDOS
Característic
as
Moleculares
Acción en el
Organismo
Pequeño de 18
residuos de aa.
Peso Molecular
2,034 KDa
APAMINA Representa el 2% del
total del veneno

Productos
Amínicos
Naturaleza no
alérgica
Acetilcolin
a
Se encuentran
Histamina Serotonin
a
Catecolamin
as
Dopamina
Adrenalina
Noradrenalin
a
Propiedade
s
Inflamatori
as
Vasoactivas
de
con
Contribuyen
al
Reacción local del
envenenamiento
Acelera la
absorción de
alérgenos del
veneno
Peña L y
col,.2006

Coadyuvantes en
procesos
alergénicos
Péptido
s
de
Enzima
s
Aminas
los cuales son
Ácido
Fórmico
Ácido
Clorhídrico
Ácido Orto-fosfórico
Enzima α-
glucosidasa
Inhibidor de proteasas Fosfato
Magnesio Glucosa
Secaparina
Aceites
Volátiles
y en menores
concentracion
es
Tertiapina
Fructosa
Propiedades
Fisicoquímica
s
Efecto
Fisiopatológic
o
Péptido de 21
aas
Actúa en canales
muscarinicos de
K+ en cel. del
miocardio
Péptido de 25
aas
No se conoce su
actividad
biológica.
Vit P, 2005; de Roodt A y col., 2005; Huertas V y col.,

DOSIS LETAL 50
TOXICIDAD
Veneno de
Abejas
del
DESCONOCIDO
Por vía
endovenosa
2,5 – 2,8 mg/ Kg
en
y
en
HHuummaannooss
RRaattoonneess
Peña L y
col,.2006

Inexistencia de Suero Antiofídico de
Abejas (Apis mellifera) de América
Latina
Estudio realizado para su
elaboración en Brasil por el
C.E.V.A.P.
Ampliación del
estudio
Variedades
de venenos
Colombia
Venezuela
México
Importación a
América Latina
Se
necesita
Comparar venenos
Venezue
la
Bras
para il
Menores
costos de
inversión
Lograr
suero
antiofídico
específico y
eficaz
a países
latinoamericanos

PPLLAANNTTEEAAMMIIEENNTTOO
DDEELL PPRROOBBLLEEMMAA

PROB LEMA
CCuuaall eess llaa ccoommppoossiicciióónn qquuíímmiiccaa ddee llooss vveenneennooss ddee aabbeejjaa
AAppiiss mmeelllliiffeerraa vveenneezzoollaannaass yy bbrraassiilleeññaa

COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL VENENO DE
ABEJA
Muestras de Veneno
Establecieron
Pool de
Veneno
que
Reúne veneno de
≠ individuos de
la misma especie
Caract.
individuales
Edad
Sexo
Dieta
Promedia a la
población
Sumado a la
espectrometría
Permite analizar
pocas cantidades
Técnicas de determinación
de proteínas
Yanez y
col.
Establecieron que
la
Espectroscopi
determina a de masa
Proteín
as
Péptido
s
> 20
KDa
Establecieron que
la
Geles de 2D
de
electroforesis
presenta
como
Desventaja
Ventaja
Detecta
proteínas
de un
extracto
biológico
↓
Sensibilidad
>
20KDa
Favreau y
col.
Favreau y
col.
Los métodos de
manipulación e
ident.
Dependen
Masa de
Cantidad
especifica
Niveles
de veneno
caract.
Disponibilidad
en bases de
datos
Avilés y
col.

Identificación de la
composición química
Peiren
Emplearo
n Electroforesi
s
Espectroscop
ia
Sobre
veneno de
abeja
Identificaron No
determinaron
Melitina
(50%)
Fosfolipasa
A2 (10-12%)
Api m6
Hialuronidas
a
Péptido
degranulado
r de
mastocitos
Apamina
Tertiapina
Por su ↓
PM
Técnicas de detección
Peiren
Establecieron
que
Electroforesi
s
Espectroscop
ia
Identifica
proteínas
de
HHiimmeennóópptteerrooss
Brochetto
y col.
Determinaro
n que
Técnicas
Cromatográfic
as
Identifican sub-especies
de
Apis mellifera
Analizando
muestras de
veneno
HPLC
es susceptibles
al modo de
extracción
Estimulaci
ón eléctrica
Ruptura de
glándula
Ya sea por:
ABEJA
Muestras de Veneno Técnicas de determinación
de proteínas

Identificación de la
composición química Técnicas de detección
Variación de los
componentes
químicos
Creer y
col.
Analizaron
100
especímenes
de serpientes
Ceraste
Y
determinaron
Variaciones
en la
composición
Debido del veneno
a:
Selección
Natural
Dietas de los
individuos
Dependen de
La región que
habitan
Métodos de
obtención del Veneno
Depablos
y col.
Evaluaron
Extractor
electrónico de
apitoxina
Obteniend
o
↓ Mortalidad
de abejas
(0,03%)
siendo
Ecológico
Eficaz
Red
Eléctrica
Placa de
Vidrio
Gota de
Veneno
ABEJA
Muestras de Veneno Técnicas de determinación
de proteínas

HIPÓTESIS
Los venenos de abejas correspondientes aa llaa eessppeecciieess
AAppiiss mmeellllííffeerraa ddee oorriiggeenn vveenneezzoollaannoo yy bbrraassiilleeññoo pprreesseennttaann
ddiiffeerreenncciiaass eenn ccuuaannttoo aa ssuu ccoommppoossiicciióónn qquuíímmiiccaa

OBJETIVOS
GENERAL
ESPECÍFICOS
Identificar taxonómicamente la
existencia de abejas Apis mellífera en
un apiario del estado del Mérida.
Comparar la composición
química de los venenos de
abejas (Apis mellifera) de
una región venezolana
(Mérida) y una brasileña (Säo
Paulo).
Aplicar métodos de estimulación por
electroshock para la obtención del
veneno de abejas (Apis mellifera).
Determinar los constituyentes del
veneno de abeja (Apis mellifera) de
una región venezolana (Mérida),
mediante la utilización de técnicas
ap r oDpeiatedrams.inar los constituyentes del
veneno de abeja (Apis mellifera) de
una región brasileña (Säo Paulo),
mediante la utilización de técnicas
a pro piaCdoams.parar las composiciones
químicas de las abejas (Apis mellifera)
de una región venezolana (Mérida) y
brasileña (Säo Paulo).

MMAATTEERRIIAALLEESS YY
MMÉÉTTOODDOOSS

MATERIALES Y
MÉTODOS
MMAARRCCOO MMEETTOODDOOLLÓÓGGIICCOO
DISEÑO DEL
ESTUDIO
TIPO DE ESTUDIO
Expo facto Correlaciona Experimental
UNIVERSO POBLACIÓN
MUESTRA CRITERIOS DE
EXCLUSIÓN
l
Aplicado
Conjunto de abejas de la
especie Apis mellífera que
habitan en un apiario
Composición química del
veneno de abejas Apis
mellífera venezolanas y
brasileñas
Pool de veneno (extracciones
obtenidas de cada una de las
poblaciones de abejas)
Ausencia de colonias de
la especie Apis mellifera
Muestras de veneno
No preservadas adecuadamente
No recolectadas por método de
electroshock

MATERIALES
Y MÉTODOS
MMEETTOODDOOLLOOGGÍÍAA
Obtención de
Muestra de
Veneno
Abejas
Venezolan
as
Abejas
Brasileñas
En
un Apiari
o
Identificació
n
taxonómica
Edo. Mérida
1.700
msnm
22 ºC
Obtenido
por
importación
Reg.
Botacatu
En un Apiari
o
Identificació
n
taxonómica
636 msnm
25 ºC
C.E.V.A.P

Extracción
del Veneno
A través
de una Trampa de
Electroshock
Fundamen
to
Estímulos
con
Impulsos
eléctricos
sobre adquiriendo
Peq. cant.
de veneno
Sin causar
muerte
Diseño Elaboraci
formando
Pool de
veneno
ón
Será
realizada por
C.E.V.A.P
MATERIALES
Y MÉTODOS
Obtención de
Muestra de
Veneno

Obtención de
Muestra de
Veneno
Manejo del
Veneno
los Pools de
Venenos
Se conservaran
por
Liofilizació
n
En que
se
Elimina la
humedad
MATERIALES
Y MÉTODOS
Extracción
del Veneno

Obtención de
Muestra de
Veneno
Extracción
del Veneno
Análisis del
Veneno
Venenos
liofilizado
s
Se
separaran
moléculas
Proteínas
Péptidos
de una
Mezcla
compleja
Proceso
de
Diálisis
Proteínas
Solvente
y Sales
Se separa
Basado en
tamaño
molecular
Adecuara a
pH neutro a
las proteínas
Por acción
del
Acido Fórmico
a 0,1 m
MATERIALES
Y MÉTODOS
Manejo del
Veneno

Obtención de
Muestra de
Veneno
Extracción
del Veneno
Análisis del
Veneno
Venenos
liofilizado
s
Se
separaran
moléculas
Proteínas
Péptidos
de una
Mezcla
compleja
Proceso
de
Diálisis
Manejo del
Veneno
Aplicación de
Columnas
Cromatográfica
s
de Exclusión o
Filtración de
gel
Se
disolverá
Veneno
Liofilizad
o
Ácido
Acético
Actuara como
Fase
Móvil
Buffer
Lavado de
Columna
Ejercerá
Mecanismo
de exclusión
A través
de
Esferas de gel de
≠ diámetros de
poros
Según la
Proteína a
separar
Proteína Melitina Apamina
PM (Da) 2.840 2.038
Sephadex G25
Proteína Fosfolipas
a
Hialuronida
sa
PM (Da) 14.000 50.000
Sephadex G75
L. de
exclusión
3.000-80.000
L. de
exclusión
1.000-5.000
MATERIALES
Y MÉTODOS
Obispo T, 2002

Obtención de
Muestra de
Veneno
Extracción
del Veneno
Análisis del
Veneno
Venenos
liofilizado
s
Se
separaran
moléculas
Proteínas
Péptidos
de una
Mezcla
compleja
Proceso
de
Diálisis
Manejo del
Veneno
Aplicación de
Columnas
Cromatográfica
s
Presencia de
proteínas
Se
evaluara
porActividad
Enzimática
Espectroscopia
de masa
Actividad
microbiana
Otra
MATERIALES
Y MÉTODOS

Obtención de
Muestra de
Veneno
Extracción
del Veneno
Análisis del
Veneno
Venenos
liofilizado
s
Se
separaran
moléculas
Proteínas
Péptidos
de una
Mezcla
compleja
Proceso
de
Diálisis
Manejo del
Veneno
Aplicación de
Columnas
Cromatográfica
s
Presencia de
proteínas
Componentes
de menor
tamaño
Se
aplicara
Electrofores
is
75 vol/cm
P.Poliacrilam
ida
P.Celulosa
En
Con gradiente
Se basa
Sep. moléculas
por carga
Ventajas del
procedimiento
Separa
proteína
s
Identific
a
proteína
s
con corridas
de
Sustanci
a
problem
a
Patrone
s
En la misma placa
MATERIALES
Y MÉTODOS

Universo a estudiar
C
O
M
P
A
R
A
C
I
Ó
N
Origen
Venezolano
(Mérida)
Brasileño
(Säo
Paulo)
Abeja
Especie:
Apis
mellifera
Identificación Composició
VENENO
n Química
Apiari
o
Identificació
n
Taxonómica
Muestras
de
Veneno
Tramp
a
Abeja
EESSTTIIMMUULLAACCIIÓÓ
NN
electroshock
Importació
n
Muestras
de
Veneno
PPOOOOLL DDEE VVEENNEENNOO
Identificación
de
componentes
Composición
Química
CCoommppaarraacciióónn QQuuíímmiiccaa
ddee llooss VVeenneennooss
Métodos de
Conservación
:
-Liofilización
-Diálisis
Materiale
s:
-Buffer
-Membrana
Métodos de
Análisis:
Cromatografí
a
Electroforesis
Materiales:
Columnas,
Resinas, Tubos de
ensayo. Gel,
Placas. Electrodos,
Patrones,
Reactivos
PLAN DE
TRABAJO

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