se describe la funcionalidad del factor trif ademas de su relacion con ADAMS 15 y las celulas dendritas, asi como tambien su interaccion con TLR 3 y TLR 4

1. 1
TRIF: El interferón-β que induce el dominio TIR
Daniel Ernesto Unigarro Flores
Universidad Técnica de Manabí
e-mail: daniernesuniflo18@gmail.com
Resumen
Los TLR3 transmite señales a través de TRIF y activa IRF3 (factor de regulación de
interferón 3) e induce la expresión de interferones del tipo I. TLR4 transmite señales a través
de MyD88 y TRIF, y es capaz de inducir los dos tipos de respuestas. El IRF3 fosforilado
dimeriza y se transloca al núcleo induciendo la transcripción de genes IFN tipo I. Además,
TRIF interacciona con TRAF6 activando a TAK1 y por tanto induce también la activación
tardía del factor de transcripción NF- κB y de las MAPKs.
La expresión de TRIF puede ser inducida por estímulos múltiples, tales como los ligandos
para TLR2, TLR3 y TLR4, y por las citoquinas proinflamatorias, factor de necrosis tumoral
alfa e interleucina-1alfa. Todos estos estímulos actúan a través de un motivo NF-kappaB.
Después de la estimulación de células con un ligando TLR3 o TLR4, se identifica una
desintegrina y metaloproteasa (ADAM) 15 como un nuevo compañero TRIF -
interacting. Hacia la caracterización funcional de la interacción TRIF: ADAM15, mostro que
ADAM15 actúa como un regulador negativo de la actividad del gen reportero NF-κBe IFN-
β mediado por TRIF.
TLR4 y TLR3 pueden usar el adaptador que contiene el dominio receptor Toll-IL-1 que
induce la vía de señalización dependiente de IFN-β (TRIF) que conduce al factor regulador
de IFN 3 (IRF3) la activación e inducción de IFN-β y -α4. La vía de señalización TRIF
también conduce a la maduración de DC, y se ha propuesto que los IFN de tipo I actúen
en inducir la maduración de DC y los efectos posteriores sobre la inmunidad adaptativa
Sumary.
The TLR3 transmits signals through TRIF and activates IRF3 (interferon 3 regulation factor)
and induces the expression of type I interferons. TLR4 transmits signals through MyD88 and

2. 2
TRIF, and is able to induce the two types of responses. The phosphorylated IRF3 dimerizes
and translocates to the nucleus, inducing the transcription of IFN type I genes. In addition,
TRIF interacts with TRAF6 activating TAK1 and therefore also induces the late activation
of the transcription factor NF-κB and MAPKs.
The expression of TRIF can be induced by multiple stimuli, such as the ligands for TLR2,
TLR3 and TLR4, and by proinflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha and
interleukin-1alpha. All these stimuli act through an NF-kappaB motif.
After stimulation of cells with a TLR3 or TLR4 ligand, a disintegrin and metalloprotease
(ADAM) 15 is identified as a new TRIF -interacting partner. Towards the functional
characterization of the TRIF: ADAM15 interaction, it showed that ADAM15 acts as a
negative regulator of the activity of the reporter gene NF-κB and IFN-β mediated by TRIF.
TLR4 and TLR3 can use the adapter containing the Toll-IL-1 receptor domain that induces
the IFN-β-dependent signaling pathway (TRIF) that leads to the IFN-3 regulatory factor
(IRF3) the activation and induction of IFN-β and -α4. The TRIF signaling pathway also leads
to DC maturation, and it has been proposed that type I IFNs act to induce DC maturation and
subsequent effects on adaptive immunity

3. 3
Introducción:
Los receptores de tipo toll (TLR) son un grupo de receptores de reconocimiento de patrones
que juegan un papel crucial en el reconocimiento del peligro y la inducción de la respuesta
inmune innata contra infecciones bacterianas y virales, estos utilizan diferentes adaptadores
e intermediarios de transmisión de señales, lo que constituye la base sus efectos anterógrados
comunes y únicos.
Cuando un ligando se une a su receptor TLR, este dimeriza, formando de esta manera tanto
homodimeros (TLR4) como heterodimeros (TRLR 1 y 2). Todos los TLR, excepto TLR3,
envían las señales a través de MyD88 (respuesta primaria de diferenciación mieloide 88) y
son capaces de activar NF-kB y de inducir una respuesta inflamatoria. Los TLR3 transmite
señales a través de TRIF y activa IRF3 (factor de regulación de interferón 3) e induce la
expresión de interferones del tipo I. TLR4 transmite señales a través de MyD88 y TRIF, y es
capaz de inducir los dos tipos de respuestas.
Nos enfocaremos más en la en la vía independiente de MYD88 haciendo énfasis en las
moléculas adaptadoras TRIF (interferón-β que induce el dominio TIR) y los TLR3 que ejerce
su función a través de una vía independiente de MyD88. La señalización de TLR4 puede
desencadenar una respuesta a través de la vía independiente de MyD88, lo que lo convierte
en el único receptor capaz de mediar una respuesta por ambas vías. TLR3 y 4 reclutan al
adaptador TRIF, el cual interacciona con TBK1 (quinasa de unión a TANK1) y una vez que
TBK1 está activada, interacciona con IKKε y fosforila al factor de transcripción IRF3 (factor
regulador de interferón). IRF3 fosforilado dimeriza y se transloca al núcleo induciendo la
transcripción de genes IFN tipo I. Además, TRIF interacciona con TRAF6 activando a TAK1
y por tanto induce también la activación tardía del factor de transcripción NF- κB y de las
MAPKs.
La proteína interfertora beta que induce el dominio TRIF que induce el interferón
beta; también conocido como TICAM-1 (molécula adaptadora-1 que contiene TIR)] es un
adaptador clave para señalización mediada por TLR3 (Toll-like receptor 3) y TLR4. El TRIF

4. 4
humano se mapea en el cromosoma 19p13.3 y está flanqueado hacia arriba por TIP47, que
codifica la proteína de unión al receptor 6-fosfato de manosa, y hacia abajo por un gen que
codifica FEM1a, un homólogo humano del gen de Feminización-1 de Caenorhabditis
elegans. Usando constructos de eliminación de promotor-informador, se identificó una
región distal con la capacidad de regular negativamente la transcripción basal y una región
proximal que contiene un sitio Sp1 (proteína estimulante 1) que confiere aprox. 75% de la
actividad transcripcional basal. La expresión de TRIF puede ser inducida por estímulos
múltiples, tales como los ligandos para TLR2, TLR3 y TLR4, y por las citoquinas
proinflamatorias, factor de necrosis tumoral alfa e interleucina-1alfa. Todos estos estímulos
actúan a través de un motivo NF-kappaB (factor nuclear-kappaB).
La molécula adaptadora de TLR, adaptador que contiene el dominio Toll / IL-1R que induce
IFN ( TRIF ), facilita la señalización de TLR3 y TLR4 y la activación concomitante de los
factores de transcripción, NF-κBy factor regulador 3 de IFN, que conducen a la producción
de citocina proinflamatoria. Mientras que se han realizado numerosos estudios para
comprender el papel de TRIF en la señalización de TLR, se sabe poco sobre los componentes
de señalización que regulan la señalización de TLR dependiente de TRIF. Después de la
estimulación de células con un ligando TLR3 o TLR4, se identifica una desintegrina y
metaloproteasa (ADAM) 15 como un nuevo compañero TRIF -interacting. Hacia la
caracterización funcional de la interacción TRIF: ADAM15, mostro que ADAM15 actúa
como un regulador negativo de la actividad del gen reportero NF-κB e IFN-β mediado
por TRIF . Además, la supresión de la expresión de ADAM15 aumentó el ácido
poliribocínico poliriboinosínico y la producción de citocina proinflamatoria mediada por LPS
a través de TRIF. Además, la supresión de la expresión de ADAM15 mejoró la producción
de citocina proinflamatoria mediada por el rinovirus 16 y la estomatitis vesicular. ADAM15
media la división proteolítica de TRIF . Por lo tanto, ADAM15 sirve para reducir
la señalización de TLR3 y TLR4 dependiente de TRIF y, al hacerlo, protege al huésped de la
producción excesiva de citoquinas proinflamatorias y metaloproteinasas de matriz.
El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos por receptores TLR en
células dendríticas (DC) conduce a la maduración de DC, un proceso que implica la

5. 5
regulación al alza de MHC y las moléculas coestimuladoras y la secreción de citoquinas
proinflamatorias. Todos los TLR excepto TLR3 alcanzan estos resultados utilizando
MYD88. TLR4 y TLR3 pueden usar el adaptador que contiene el dominio receptor Toll-IL-
1 que induce la vía de señalización dependiente de IFN-β (TRIF) que conduce al factor
regulador de IFN 3 (IRF3) la activación e inducción de IFN-β y -α4. La vía de señalización
TRIF también conduce a la maduración de DC, y se ha propuesto que los IFN de tipo I actúen
en inducir la maduración de DC y los efectos posteriores sobre la inmunidad adaptativa. La
maduración de DC inducida por TLR4-TRIF era independiente tanto de IRF3 como de IFN
de tipo I. Por el contrario, la maduración de DC mediada por TLR3 fue completamente
dependiente de la retroalimentación de IFN de tipo I. Encontramos que la activación
diferencial de proteína quinasas activadas por mitógeno por los ejes TLR4 y TLR3-TRIF
determinó la dependencia de IFN de tipo I para la maduración de DC. Además, la capacidad
adyuvante de LPS para inducir la activación de células T es completamente independiente de
los IFN de tipo I.

6. 6
Regulación transcripcional del gen TRIF
El análisis del gen humano TRIF y los mecanismos por los que se regula se realizó debido a
la función clave que desempeña TRIF en la transducción de señales por TLR3 y TLR4. La
posición de TRIF en el genoma humano se encuentra en el cromosoma HSA 19p13.3,
transcrito hacia el telómero. Hacia abajo del TRIF se encuentra un gen llamado FEM1A un
pequeño gen que codifica un homólogo humano del factor de determinación sexual,
Caenorhabditis elegans Feminización-1 o Fem-1, que se transcribe en el orientación opuesta
a TRIF. Curiosamente, otro homólogo Fem-1 humano, FEM1C, que codifica otra proteína
adaptadora TLR cuya función está íntimamente ligada a la de TRIF al actuar como un
intermediario entre TRIF y TLR4. La alineación FEM1A / TRIF-FEM1C / TRAM está
presente en el genoma murino, lo que sugiere que estos genes están en posiciones de sintenia
conservada. Sin embargo, al análisar del genoma de C. elegans sugiere que la aparición de
TRIF y TRAM en la evolución ocurrió después de la divergencia del nematodo del linaje que
conduce a los vertebrados, ya que los genes que flanquean Fem-1 en C. elegans no están
relacionados y no hay genes directamente análogos a TRIF o TRAM. En el nematodo, Drp-
1, el gen que codifica la proteína relacionada con dynamin-1, se encuentra hacia arriba de
Fem-1; hacia abajo se encuentra un gen llamado Unc-5 (locomoción-5 descoordinada).
Ambos genes tienen homólogos humanos en diferentes cromosomas a TRIF y TRAM.
Los homólogos de TRIF y TRAM se encontraron en el pez cebra Danio rerio, sin embargo,
lo que sugiere que estos genes pueden haber surgido con la vida de los vertebrados.
Desafortunadamente, no hay suficiente información de secuencia para mapear el gen de D.
rerio Fem-1, por lo que su relación con TRIF y TRAM aún no se conoce.
Debido a que TRIF y TRAM, y FEM1a y FEM1c, están relacionados uno con el otro en
secuencia, es probable que ocurra un evento de duplicación en la región del genoma que
contenga TRIF y FEM1a o TRAM y FEM1c, dando lugar a cada homólogo. Cada uno habría
desarrollado una nueva función, lo que implica que TRIF y TRAM tienen funciones
específicas. La función de TRAM parece estar en el reclutamiento de TRIF para el complejo
de señalización TLR4, aunque por qué TRIF no puede ser reclutado directamente a TLR4,
como es el caso con TLR3, no está claro en esta etapa.

7. 7
En la identificación de un supuesto promotor de TRIF primero se busco regiones conservadas
no codificantes en los genes ortólogos de TRIF humano y murino, ya que las comparaciones
de secuencias no codificantes en regiones sinténicas han tenido éxito en la identificación de
elementos comunes que regulan la expresión génica. Al no identificar regiones conservadas
no codificadoras, sugiere una regulación diferencial de TRIF humana y murina. Sin embargo,
una inspección más cercana de las dos secuencias mediante análisis Clustal W revela la
conservación de sitios de unión de factores de transcripción individuales, como los de Sp1 y
NF-κB , en la región flanqueante 5_ proximal al exón 1 de TRIF. Al analizar la región de
flanqueo 5_ de TRIF para elementos repetitivos se encontró que la mayor parte de ella se
compone de repeticiones tales como elementos intercalados cortos y largos. Aunque estudios
previos han demostrado que los elementos repetitivos pueden regular la transcripción de
manera positiva o negativa, la presencia de un tramo de elementos continuos del gen TRIF
sugiere que estos elementos probablemente no participen en la regulación de TRIF.
En el análisis de la función basal o constitutiva de TRIF se observa que un sitio de unión al
factor de transcripción Sp1 es el responsable de la mayor parte de la actividad basal de TRIF.
Además la participación de Sp1 en la actividad basal es similar a la observada para el gen
murino Tlr2, lo que sugiere que la regulación de genes que codifican componentes de
señalización TLR puede tener elementos comunes. Los experimentos que examinaron la
inducibilidad de TRIF mediante una variedad de estímulos tales como LPS, poli y TNFα
mostraron que otro factor de transcripción, NF-κB, es crítico para la activación del gen. La
eliminación del sitio TRIF NF-κB, ya sea por delección o por mutación de cuatro nucleótidos
críticos, da como resultado una abrogación completa de la inducibilidad de TRIF. Además
de la IκB SR también es capaz de abrogar la inducción TRIF por todos los estímulos
probados. Esto demuestra un requisito absoluto para NF-κB para la activación de TRIF.
El promotor TRIF difiere del de MyD88, el único otro promotor que contiene el dominio TIR
para ser analizado funcionalmente. El promotor MyD88 no contiene ningún motivo NF-κB,
y parece estar regulado a través de sitios de unión superpuestos para STAT1, IRF1 e IRF2.
Esto proporciona una explicación molecular para la inducción de MyD88 por IL-6 y otros
activadores de STAT1. TRIF, por el contrario, será inducido por estímulos inflamatorios que

8. 8
activan NF-κB. Por lo tanto, TRIF es un gen de respuesta inflamatoria más general. Trabajos
recientes usando micromatrices han indicado que la mayoría de los genes regulados por LPS
están en la vía llamada MyD88-independent. Estos están supuestamente regulados por TRIF,
lo que lo convierte en el adaptador más prominente para TLR4. También es el adaptador
principal para TLR3. Esta prominencia también se refleja en la gran cantidad de agentes
inflamatorios que inducirían TRIF en comparación con MyD88. La inducción de TRIF por
los estímulos evaluados, fue relativamente débil en comparación con la de otros promotores,
lo que sugiere que la expresión basal de TRIF es adecuada para la respuesta inicial a TLR3
o TLR4. Sin embargo, TRIF es claramente inducible, y el nivel de inducción de su ARNm
por los estímulos fue algo mayor que la inducción del promotor. Es probable que TRIF sea
inducido durante la inflamación, promoviendo respuestas a ligandos para TLR3 y TLR4
durante la inmunidad innata.
Debido a que TLR3 y TLR4 activan NF-κB, es probable que opere un ciclo de
retroalimentación positiva que potencie la respuesta a estos TLR. Otra posibilidad podría ser
que la inducción de TRIF podría sesgar la vía de señalización activada por TLR4, ya que
TLR4 utiliza cuatro adaptadores. Mal y MyD88 regulan la activación temprana de NF-κB,
mientras que TRAM y TRIF regulan la activación tardía y también la activación de IRF3, lo
que lleva a la inducción de IFNβ. La inducción de TRIF podría, por lo tanto, promover estas
dos señales, lo que permite una estadificación del momento de inducción del gen durante la
defensa del huésped. Dado que también se identificó un motivo STAT1 putativo en el
promotor TRIF, TLR3 y TLR4 inducirían IFNβ, lo que a su vez induciría la expresión de
TRIF. El promotor TRIF demostró ser insensible a IFN de tipo I. En fin se identificó a NF-
κB como el factor clave de transcripción que regula la expresión del gen TRIF. Por lo tanto,
es probable que TRIF se induzca durante la inflamación, donde potenciará las respuestas a
los PAMP detectados por TLR3 y TLR4, y por lo tanto promoverá la inmunidad innata.

9. 9
La señalización de TLR3 y TLR4 mediada por TRIF está regulada negativamente por
ADAM15
ADAM15 y su interacción con TRIF
Al explorar los mecanismos moleculares que modulan la funcionalidad de TLR3 después de
la detección viral, TRIF se sobre expresa en células HEK293-TLR3, seguido de estimulación
de células con el ligando sintético TLR3, poli (I: C) y SDS-PAGE del inmunocomplejo TRIF.
Curiosamente, ADAM15 se ha identificado como un interactor TRIF.
Para confirmar que TRIF y ADAM15 están asociados, se realizaron experimentos de
coinmunoprecipitación. Se descubrió que el TRIF marcado con HA coinmunoprecipitó con
ADAM15 marcado con V5 después de la estimulación con poli (I: C). Notablemente, estos
experimentos se realizaron en presencia de los quelantes de metales, EGTA y EDTA, para
deteriorar la actividad catalítica de ADAM15, una proteinasa dependiente de Zn. La
capacidad del TRIF endógeno para interactuar con ADAM15 endógeno también se examinó
usando células U373-CD14 humanas. En correlación con los datos de sobreexpresión, se
encontró que ADAM15 endógeno coimmunoprecipitado con TRIF endógeno después de la
estimulación de las células con poli (I: C). La expresión de TRIF igual se confirmó mediante
análisis de inmunotransferencia de los lisados de células completas.
La actividad del gen reportero dependiente de TRIF a través de TLR3 y TLR4 es
inhibida por ADAM15.
Dado que ADAM15 interactúa con TRIF de una manera dependiente de ligando, se intentó
examinar la capacidad de ADAM15 para modular la funcionalidad de TRIF.
Se encontró que ADAM15 inhibía la activación mediada por TRIF de la actividad del gen
informador NF-κB, IFN-β p125, PRDII y PRDIII. A altas concentraciones de ADN de
ADAM15, la activación del gen reportero de NF-κBdependiente de MyD88 se vio afectada.
Sin embargo, la sobreexpresión de bajas cantidades de ADAM15 potenciaba la activación
dependiente de MyD88 de la actividad del gen reportero de IFN-β y no afectaba la actividad
del gen indicador de NF-κB dependiente de MyD88. De manera importante, encontramos
que la sobreexpresión de ADAM15 no afectó a la actividad del gen reportero de NF-κB
dependiente de MDA5.

10. 10
Como TRIF media la señalización de TLR3 y TLR4, se investigó el efecto de ADAM15
sobre la activación del gen indicador NF-κBe IFN-βdependiente de TLR3 y TLR4 utilizando
células HEK293 que expresan establemente TLR3 o TLR4. En células HEK293-TLR3, la
sobreexpresión de ADAM15 inhibió significativamente la activación dependiente de TLR3
de los genes informadores NF-κB e IFN-β. Además, en células HEK293-TLR4, la
sobreexpresión de ADAM15 redujo significativamente la activación del gen indicador de
NF-κB e IFN-β dependiente de TLR4. Además, la sobreexpresión de ADAM15 no afecta a
la actividad del gen informador de NF-κB e IFN-β dependiente de TLR9. Esto demuestra
que ADAM15 regula negativamente la señalización de TLR3 y TLR4 dependiente de TRIF,
pero no la señalización de TLR9 independiente de TRIF. Para confirmar que ADAM15
inhibe la activación de NF-κB mediada por TLR4, se suprimió la expresión de ADAM15,
seguido del examen del estado de fosforilación de la subunidad NF-κB, p65, después de la
estimulación con LPS. Tras la supresión de la expresión de ADAM15 y la estimulación de
células con LPS, se encontró que, aunque se suprimió la fosforilación de p65 a los 30 min, la
fosforilación de p65 a los 120 min se potenciaba después de la supresión de la expresión de
ADAM15. Esto indica que mientras la activación de NF-κB en etapa tardía, mediada por
TRIF, es suprimida por ADAM15, ADAM15 potencia la activación de NF-κB dependiente
de MyD88 en la etapa inicial.
La supresión de la expresión de ADAM15 potencia la citocina proinflamatoria y modula
los niveles de MMP
Dado que ADAM15 suprime la actividad del gen indicador mediado por TLR3 y TLR4 y la
activación tardía de NF-κBa través de un mecanismo que implica TRIF, se trata de establecer
si ADAM15 afectaba a la señalización mediada por TLR3 y TLR4 aguas abajo de su
respectiva transcripción factores. Con este fin, se examinó la expresión transcripcional de
citocinas proinflamatorias después de la participación de TLR3 y TLR4 en ausencia y
presencia de ADAM15. Se encontro que el silenciamiento de ADAM15 potenciaba
significativamente la inducción de poli (I: C) y LPS inducida por IFN-β, TNF-α y RANTES,
respectivamente, en células humanas. La secreción y actividad de MMP-9 se abolió en la
línea celular PC-3 de cáncer de próstata metastásico después de la supresión de la expresión
de ADAM15. Se ha propuesto que la activación de la actividad de MMP-9 se puede iniciar

11. 11
con la unión del ligando de TLR. Además, se ha demostrado que el compromiso de TLR3 y
TLR2 mejora la expresión de MMP-9 y MMP-10. Dado el vínculo entre TLR, ADAM15 y
MMP. Se encontró que la supresión de la expresión de ADAM15 disminuía la inducción
mediada por LPS de mRNA de MMP-9 y MMP-10 en comparación con las células de
control. Sorprendentemente, la supresión de ADAM15 mejoró significativamente la
expresión de ARNm de MMP-9 mediada por poli (I: C) y MMP-10 cuando se comparó con
células de control. Estos datos indican que, mientras que ADAM15 es necesaria para la
inducción de mRNA de MMP-9 y MMP-10 inducida por LPS, daña la inducción de MMP-9
y MMP-10 conducidas por poli (I: C).
Se evaluó el efecto de ADAM15 sobre la inducción de citoquina, quimiocina y MMP
mediada por TLR3 y TLR4, y se encontró que la supresión de la expresión de ADAM15
aumentaba de manera consistente y significativa el IFN-β inducido por poli (I: C), IFN-γ, IL-
12p70, CCL5 y TNF-α. Además, la supresión de ADAM15 potenciaba los niveles de IFN-β,
IFN-γ, IL-12p70 y CCL5 inducidos por LPS en comparación con las células control no
estimuladas. Después de la estimulación con LPS, también se observaron aumentos en los
niveles de TNF-α después de la supresión de ADAM15, aunque los niveles no fueron
significativos. Los niveles de IL-6, IL-8 e IL-1β no se vieron afectados. La transcripción de
muchas MMP es promovida por TLR ligandos, citocinas inflamatorias y quimiocinas. Por lo
tanto, los niveles de MMP-1, MMP-3 y MMP-9 en los sobrenadantes libres de células
también se midieron después de la supresión de ADAM15 y la posterior estimulación de las
células con poli (I: C) y LPS. La supresión de ADAM15 aumentó significativamente los
niveles de MMP-1, MMP-3 y MMP-9 inducidos por poli (I: C). La supresión de ADAM15
también mejoró significativamente los niveles de MMP-3 y MMP-1 inducidos por LPS.
Curiosamente, la supresión de ADAM15 disminuyó significativamente la secreción de
MMP-9 inducida por LPS. Estos datos sugieren que ADAM15 desempeña un papel en la
regulación negativa de la poli (I: C) y la inducción de citoquinas y quimiocinas mediada por
LPS. Por lo tanto, mientras que ADAM15 es necesaria para la producción de MMP-1 y
MMP-3 impulsada por poli (I: C) y LPS, ADAM15 modula diferencialmente la producción
de MMP-9 poli (I: C) y mediada por LPS.

12. 12
ADAM15 media la degradación de TRIF
Para explorar el mecanismo por el cual ADAM15 regula negativamente la señalización de
TLR3 y TLR4 mediada por TRIF, se intentó investigar si ADAM15 tiene la capacidad de
mediar en la degradación de TRIF y conducir a la reducción de TRIF señalización
dependiente. Con este fin, HEK293-TLR3 se transfectaron con TRIF en ausencia y presencia
de ADAM15. A partir de entonces, las células se dejaron sin tratar o se estimularon con poli
(I: C), en ausencia de EDTA y EGTA, que se sabe que inhiben parcialmente la actividad
proteasa de ADAM15. La sobreexpresión de ADAM15 facilitó la degradación de TRIF, pero
no MyD88. Notablemente, la coexpresión de TRIF con ADAM15 catalíticamente activo
condujo a la degradación de TRIF. Algunos ADAM se pueden escindir y posteriormente
translocarse al núcleo. Por lo tanto, se investigo la distribución subcelular de ADAM15
después de la estimulación de células con poli (I: C). Con este fin, ADAM15 se sobreexpresó
en HEK293-TLR3. A continuación, las células se estimularon con poli (I: C) y la localización
subcelular de ADAM15 se investigó mediante microscopía confocal. Para evitar artefactos
potenciales debido a los altos niveles de sobreexpresión, la cantidad de ADN plasmídico
transfectado en las células se mantuvo a niveles bajos. Se encontró que ADAM15 se
localizaba tanto en la membrana plasmática como en el citosol y que la estimulación con poli
(I: C) produjo un ligero aumento en los niveles de ADAM15 en el citosol, lo que muy
probablemente refleja su transporte desde el plasma membrana al núcleo. Estos datos indican
que ADAM15 y TRIF pueden colocalizarse en el citosol. La expresión de ADAM15 se
suprimió en células U373-CD14, seguido de la estimulación de células con poli (I: C). Se
detecto niveles aumentados de proteína TRIF endógena en las células después de la supresión
de la expresión de ADAM15 cuando se compararon con las células control y los niveles
disminuyeron tras la estimulación de las células con poli (I: C). en fin, ADAM15 sirve para
modular los eventos de señalización TLR3 y TLR4. Más específicamente, ADAM15 inhibe
las respuestas inmunes antivirales que están mediadas a través del adaptador TLR, TRIF, por
lo que ADAM15 funciona como un regulador negativo de la señalización de TLR3 y TLR4
mediante un mecanismo que implica la degradación de TRIF.

13. 13
Señalización mediada por TRIF en la maduración de DC inducida por TLR4 y TLR3
Todos los TLR, con la excepción de TLR3, usan la molécula adaptadora factor de
diferenciación mieloide 88 (MyD88) para la transducción de señales. TLR3 reconoce el ARN
bicatenario (ds) en los endosomas e inicia la señalización mediante el uso del adaptador
adaptador que contiene el dominio del receptor Toll-IL-1 que induce IFN-β (TRIF). TLR4
reconoce LPS y utiliza tanto MyD88 como TRIF como adaptadores de señalización. La vía
de señalización dependiente de MyD88, aguas abajo de TLR4, utiliza el adaptador de
clasificación TIRAP e induce la activación de NF-κBy MAP quinasas. La vía de señalización
TRIF, tanto aguas abajo de TLR3 como de TLR4, además de NF-κB, induce la activación de
IRF3, lo que lleva a la producción de IFN-β y -α4. Los IFN de tipo I inducidos por la
activación de TLR3 y TLR4 juegan un papel importante en varias facetas de la inmunidad
tanto innata como adaptativa. Debido a que TLR3 reconoce el ARN viral, la producción de
IFN tipo I es importante para la inducción de la inmunidad antiviral. También se ha
demostrado que la inducción de IFN de tipo I por el ligando TLR3 poli (I: C) es importante
para la maduración de DC y su posterior capacidad para activar las células T CD4. Por el
contrario, la importancia de la producción de IFN de tipo I para la inmunidad innata mediante
la vía de señalización de TLR4 no está del todo clara. Se ha propuesto que la regulación
positiva de moléculas coestimuladoras en DC por LPS se debe a la inducción de IFN de tipo
I por el eje de señalización TLR4-TRIF.
Recientemente, ha habido un interés considerable en el diseño de adyuvantes para vacunas
humanas que se dirigen a la vía TRIF de señalización aguas abajo de TLR4. Está claro que
la vía de señalización TRIF puede inducir la maduración de DC que es suficiente para la
inducción de la inmunidad adaptativa sin la abrumadora respuesta inflamatoria inducida por
la vía de señalización MyD88. El dsRNA sintético, el ligando para TLR3, también podría ser
un candidato importante para ser considerado por su efecto adyuvante en las formulaciones
de vacunas.
Se encontro que el análogo de dsRNA poli (I: C) conduce a la maduración de DC efectiva
solo cuando también activa el sensor citosólico y que la maduración de DC inducida por

14. 14
dsRNA es completamente dependiente de los IFN de tipo I secretados por las DC. Sin
embargo, la maduración de DC inducida por la ruta de señalización de TLR4 dependiente de
TRIF es independiente de los IFN de tipo I secretados por las DC. Además, encontramos que
esta dependencia de IFN de tipo I está dictada por la activación diferencial de las MAP
quinasas por la vía de señalización TRIF aguas abajo de TLR3 y TLR4.
La maduración de DC es un primer paso crítico en la sensibilización y diferenciación de las
células T vírgenes no específicas de antígeno. La maduración de DC puede ser inducida por
una variedad de ligandos que activan diferentes clases de PRR. Dos ligandos de TLR en
particular han sido de gran interés debido a su uso clínico. Poly (I: C), una réplica de dsRNA
que activa TLR3, se ha utilizado para el tratamiento del cáncer debido a su capacidad para
inducir IFN de tipo I. Además, los derivados de LPS que activan específicamente la vía TRIF
de señalización aguas abajo de TLR4 se están considerando como adyuvantes de vacuna.
Estudios anteriores han encontrado que la señalización autocrina de IFNAR es importante
para la maduración de DC por poli (I: C) para inducir el cebado de células T CD4 y la
diferenciación de Th1. También se ha propuesto que la maduración de DC inducida por LPS
a través de TLR4 también depende de la señalización de IFNAR. En este estudio,
examinamos cuidadosamente la necesidad de señalización de IFNAR para la maduración de
DC aguas abajo de los ejes de señalización TLR4 y TLR3-TRIF y descubrimos que, aunque
la maduración de DC mediada por dsRNA depende de la señalización de IFNAR, la
maduración de DC mediada por TLR4-TRIF es completamente independiente de la
producción de IFN de tipo I y de la señalización de IFNAR.
Tanto LPS como poli (I: C) tienen la capacidad de inducir la maduración de las DC
deficientes en MyD88. Aunque la vía de señalización dependiente de MyD88 aguas abajo de
TLR4 es importante para la inducción de la mayoría de las citoquinas proinflamatorias tales
como IL-6, IL-12, TNF-a, etc., la vía independiente de MyD88 o la vía de señalización
dependiente de TRIF es responsable para la activación de IRF3 y la posterior transcripción
de IFN-β y -α4. La evidencia de la utilización de IFN-α / β para la maduración de DC y la
posterior inducción de la inmunidad adaptativa por dsRNA se ha presentado anteriormente.

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Nuestros estudios establecen que la dependencia de la señalización IFNAR de tipo I para
inducir la maduración de DC está restringida solo a dsRNA.
La pregunta obvia es cómo y por qué la vía de señalización TRIF aguas abajo de TLR4 y
TLR3 es diferente. Se ha puesto de manifiesto que tanto TLR4 como TLR3 activan TRIF
desde un compartimento endosomal. La comparación directa de la señalización inducida por
LPS y poli (I: C) no es muy informativa debido a la participación de las vías de señalización
mediadas por MyD88 y RIG-I, respectivamente. El análisis de la ruta de los datos de
secuenciación de ARN de BMDCs MyD88-MAVS DKO estimulados con LPS o poli (I: C)
proporciona enormes distinciones entre los dos grupos. El eje de señalización TLR3-TRIF,
aunque es capaz de inducir ISG, no puede activar genes que dependen de NF-κB y MAP
quinasas. Sorprendentemente, TRIF también falla al activar robustamente MAP quinasas
JNK y P38, aguas abajo de TLR3 en comparación con su activación corriente abajo de TLR4.
Inhibición de p38 y JNK, pero no ERK, condujo a la reducción en la capacidad de LPS para
inducir la maduración de DC dependiente de TRIF, sugiriendo que la activación de estas
MAP quinasas es crítica para que la señalización de TLR4-TRIF induzca la maduración de
DC. La falla de poli (I: C) para inducir de manera robusta la activación de MAP quinasa se
refleja por su incapacidad para inducir la maduración directa de DC. Una posible explicación
de la falta de una robusta activación de MAP quinasa aguas abajo de TLR3 podría ser el uso
diferencial de la molécula adaptadora relacionada con TRIF (TRAM) para la señalización.
Entonces sería posible predecir que la alteración del dominio C-terminal de TLR3 para
activar TRAM lo haría comportarse de manera similar a TLR4 e inducir una señalización
robusta de NF-κB y MAP quinasa y maduración de DC independiente de IFN tipo I. Para
inducir con fuerza la activación de MAP quinasa se refleja por su incapacidad para inducir
la maduración de DC directa. Una posible explicación de la falta de una robusta activación
de MAP quinasa aguas abajo de TLR3 podría ser el uso diferencial de la molécula adaptadora
relacionada con TRIF (TRAM) para la señalización. Entonces sería posible predecir que la
alteración del dominio C-terminal de TLR3 para activar TRAM lo haría comportarse de
manera similar a TLR4 e inducir una señalización robusta de NF-κB y MAP quinasa y
maduración de DC independiente de IFN tipo I. Para inducir con fuerza la activación de
MAP quinasa se refleja por su incapacidad para inducir la maduración de DC directa. Una

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posible explicación de la falta de una robusta activación de MAP quinasa aguas abajo de
TLR3 podría ser el uso diferencial de la molécula adaptadora relacionada con TRIF (TRAM)
para la señalización. Entonces sería posible predecir que la alteración del dominio C-terminal
de TLR3 para activar TRAM lo haría comportarse de manera similar a TLR4 e inducir una
señalización robusta de NF-κB y MAP quinasa y maduración de DC independiente de IFN
tipo I.
Finalmente se evaluó la capacidad de LPS para inducir la activación y diferenciación de
células T in vivo en ausencia de señalización de IFN de tipo I. Esta investigación es
importante porque la inducción de la inmunidad Th1 de CD4 cuando se usa poli (I: C) como
adyuvante in vivo es críticamente dependiente de los IFN de tipo I. Otro estudio demostró
que la maduración de DC inducida por LPS y su adyuvanticidad también dependía de la
maduración de DC inducida por señalización de IFNAR de tipo I. No encontramos ningún
defecto en la capacidad de LPS para inducir migración y maduración de DC.
Consistentemente, el LPS pudo inducir una activación y diferenciación robusta de células
Th1 específicas de antígeno en ratones WT e IFNAR deficientes. Estos resultados son
claramente diferentes del estudio anterior, en el que la maduración de CD inducida por LPS
fue abrogada completamente en ratones deficientes en IFNAR.
Se mostró que TRIF tiene resultados diferenciales aguas abajo de TLR4 y TLR3 y que existe
un papel restringido para los IFN de tipo I en la regulación de la activación de DC y la
diferenciación de células T in vivo. A medida que avanza el diseño de adyuvantes para uso
humano, será importante comprender la capacidad de los ligandos de PRR para activar
directamente DCs o indirectamente a través de la inducción de citoquinas tales como IFN
tipo I, ya que esto podría afectar la especificidad de la respuesta.

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Conclusión
La inducción de TRIF por siertos estimulos, sugiere que la expresión basal de TRIF es
adecuada para la respuesta inicial a TLR3 o TLR4. Sin embargo, TRIF es inducible, y el
nivel de inducción de su ARNm por los estímulos es algo mayor que la inducción del
promotor. Es probable que TRIF sea inducido durante la inflamación, promoviendo
respuestas a ligandos para TLR3 y TLR4 durante la inmunidad innata.
Debajo de TRIF se encuentra un gen llamado FEM1A, que se transcribe en la orientación
opuesta a TRIF. Otro homólogo Fem-1 humano, FEM1C, que codifica otra proteína
adaptadora TLR cuya función está íntimamente ligada a la de TRIF al actuar como un
intermediario entre TRIF y TLR4. La alineación FEM1A / TRIF-FEM1C / TRAM está
presente en el genoma murino, lo que sugiere que estos genes están en posiciones de sintenia
conservada.
A altas concentraciones de ADN de ADAM15, la activación del gen reportero de NF-κB
dependiente de MyD88 se vio afectada. Sin embargo, la sobreexpresión de bajas cantidades
de ADAM15 potenciaba la activación dependiente de MyD88 de la actividad del gen
reportero de IFN-β y no afectaba la actividad del gen indicador de NF-κB dependiente de
MyD88
En células HEK293-TLR3, la sobreexpresión de ADAM15 inhibió significativamente la
activación dependiente de TLR3 de los genes informadores NF-κB e IFN-β. Además, en
células HEK293-TLR4, la sobreexpresión de ADAM15 redujo significativamente la
activación del gen indicador de NF-κB e IFN-β dependiente de TLR4. Además, la
sobreexpresión de ADAM15 no afecta a la actividad del gen informador de NF-κB e IFN-β
dependiente de TLR9. Esto demuestra que ADAM15 regula negativamente la señalización
de TLR3 y TLR4 dependiente de TRIF, pero no la señalización de TLR9 independiente de
TRIF.
El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos por receptores Toll-like
(TLR) en células dendríticas (DC) conduce a la maduración de DC, un proceso que implica
la regulación al alza de MHC y las moléculas coestimuladoras y la secreción de citoquinas
proinflamatorias. Todos los TLR excepto TLR3 alcanzan estos resultados utilizando el factor
88 de diferenciación mieloide del adaptador de señalización. TLR4 y TLR3 pueden usar el

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adaptador que contiene el dominio receptor Toll-IL-1 que induce la vía de señalización
dependiente de IFN-β (TRIF) que conduce al factor regulador de IFN 3 (IRF3) activación e
inducción de IFN-β y -α4. La vía de señalización TRIF, aguas abajo de estos dos TLR,
también conduce a la maduración de DC, y se ha propuesto que los IFN de tipo I actúen en
inducir la maduración de DC y los efectos posteriores sobre la inmunidad adaptativa.

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