Anaplasma phagocytophilum

Anaplasma
phagocytophilum
SESIÓN MICROBIOLÓGICA
14 DE SEPTIEMBRE 2017
JUAN JOSÉ FONSECA MATA
RESIDENTE INFECTOLOGÍA

Secuencia
Introducción
Vector
◦ Conflictos y cooperación
Taxonomía
Morfología
Serovariedades
Características Genéticas
Replicación
Respuesta inmune y factores de virulencia
Pruebas diagnósticas
Comentarios y conclusiones

Anaplasmosis; introducción
Enfermedad febril
mediada por
vectores,
Acompañada con
inclusiones en los
granulocitos
Relacionada al
patógeno
veterinario
Ehrlichia
phagocytophilum
y E. equi,
Denominado
Anaplasma
phagocytophilum
Descrito en
Minnesota y
Wisconsin
Clinical microbiology reviews, july 2011, p. 469–489

Vector
DNA de A. phagocytophilum se ha
detectado en múltiples especies de
garrapatas del género Ixodes
I. Scapularis
I. Pacificus
I. Spinipalpis
I. Ricunus
I. persucaltus
I. ovatus
EUA
Europa
Asia
Una vez que la garrapata se adquiere
la bacteria desde un mamífero
infectado, esta se mantiene desde la
etapa larvaria hasta la edad adulta y
es transmitida a los mamíferos en la
siguiente alimentación

Vector
Los reservorios mamíferos A.
phagocytophilum incluyen
• Ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus)
• Mapaches (Procyon lotor)
• Ardillas grises (Sciurus carolinensis)
• Zorros grises (Urocyon cinereoargenteus)
• Ardillas dela secoya

Conflicto y cooperación
PLoS Pathog. 2016 Apr 21;12(4):e1005488

Conflictos y cooperación
PLoS Pathog. 2016 Apr 21;12(4):e1005488
Teoría de la
Endosimbiosis

Taxonomía
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Alfaproteobacteria
Orden: Rickettsiales
Familia: Ehrlichiaceae
Genero: Anaplasma
Especie: A. phagocytophilum

Nat Rev Microbiol. 2010 May;8(5):328-39

Características
Toda la familia infecta a huéspedes invertebrados específicos
Neorickettsia y Wolbachia pueden ser transmitidos de manera transorvárica
Anaplasma y Ehrlichia no pueden pasar de manera efectiva de esta manera
Las bacterias infectan ciertos tipos de células en los vertebrados
• De origen hematopoyético
• neutrófilos, monocitos/macrófagos, plaquetas, eritrocitos y células endoteliales

Morfología
A. phagocytophilum
• Coco polimórfico gram negativo
• Envoltura de doble membrana
• Tamaño desde 0.4 a 1.3 µm
hasta 2 µm
• La membrana externa es rugosa
• No hay capsula
Microbes and Infection 15 (2013) 1017e1025

Morfología
Se pueden ver finas hebras de
DNA y ribosomas en la bacteria
La replicación de Anaplasma se
lleva en vacuolas intracelulares
• llamadas vacuolas de inclusión o
vacuolas parasitophoras
• Dentro del citoplasma de las células
eucariotas

Serovariedades
Todos los
aislamientos de A.
phagocytophilum
parecen tener
reactividad
cruzada en
mamíferos
El antígeno más
común es una
proteína de 42 –
49 kDa expresada
en la membrana
externa
bacteriana, parte
de la familia P44
Las diferentes
cepas muestran
variaciones
menores en la
secuencia genética
del RNA 16S y del
gen groESL

Serovariedades

Genoma
Genoma de 1.47 Mpb
• ¼ del tamaño del de E. coli
1369 ORFs
Contenido de G-C representa el
41.6%,
• menor que en E. coli (50%)
• mayor que en R. prowasekii (29.1%)
Numerosas secuencias
repetidas
• 100 copias del gen P44
• Sistema de secreción tipo IV
No tiene genes que expresen
• Lipopolisacaridos
• Peptidoglucanos

Genoma
Nat Rev Microbiol. 2010 May;8(5):328-39.

Genoma
A. phagocytophilum y R. prowazekii comparten 469 genes
No pueden utilizar glucosa como fuente de energía
A. phagocytophilum tiene una vía de glucolisis parcial que inicia con
fructosa 1 – 6 bifosfato
Tiene vías de metabolismo aeróbico

Genoma
No codifica un citocromo oxidasa tipo-d*
No tiene traslocasa de ATP/ADP*
Tiene genes que codifican enzimas para la síntesis de nucleótidos y casi
todos las vitaminas y cofactores que puede favorecer a la garrapata*
Puede sintetizar solo 4 aminoácidos (glicina, glutmina, glutamato,
aspartato)*

Genoma

Antígeno mayor de superficie P44/Msp2
Superficie antigénica de superficie
Útil en el serodiagnóstico
Son proteínas beta-cilindros
• Actividad de porina
• Permiten la difusión pasiva de pequeñas
moléculas hidrofilicas
Los genes de codificación de P44 se
componen
• Una región codificante hipervariable
• flanqueada por regiones 5’ y 3’ conservadas
La variabilidad antigénica de P44
contribuye
• Evasión inmune
• Infección persistente de A.
phagocytophulum

Sistema de secreción tipo IV
Cuenta con
homólogos
de los SST I
y IV
SST IV
Canal
transmembrana
compuesta de
complejos
multiprotéicos
A pesar del
genoma de
menor
tamaño
Contiene 8
copias no
idénticas de los
genes de
transcripción
para los SSTIV
A. phagocytophilum
Modular la
transcripción de
los genes del
huésped
mediante AnkA,
Una de las SSTIV
que se
transporta al
núcleo de la
célula infectada.
Clin Lab Med - (2017) -–-
SSTIV: sistema de secreción tipo IV

Sistemas de dos componentes
2 sistemas de
dos
componentes
(TCSs)
sirven como
mecanismos de
respuesta a
estímulos
ambientales
Mediante la
expresión de
genes específicos
PleC, CckA, NteY
son sensores de
histidina quinasa
esenciales en la
infección
TCS: sistema de dos componentes

Receptor
Se requiere la unión del tetrasacarido sialyl Lewis (sLex)
con el ligando – 1 de la glicoproteína P – selectina (PSGL
– 1)
Su unión activa la vía del PSGL – 1 que concluye en la
fosforilación de ROCK1
◦ un efector kinasa de GTPasa
ROCK1 es una serina/treonina kinasa
◦ Regulador clave de la organización de actina
◦ Sugiere que la unión de Anaplasma con PSGL – 1 activa la
reorganización del citoesqueleto mediado por ROCK1
facilitando la invasión bacteriana
sLex: Tetrasacarido sialyl Lewis
PSGL – 1 : ligando – 1 de la glicoproteína P – selectina 1

Receptor e
internalización
ER: retículo endoplásmico
Rab: proteínas de reciclado de endosomas

Biogénesis de los gránulos de inclusión
A. phagocytophilum se divide
estrictamente dentro de los
gránulos de inclusión.
Al dividirse esos se expanden
hasta ocupar la mayor parte del
citoplasma de la célula infectada
NCF1, NCF2: componentes de la cadena de oxidasa NADPH

En los
neutrófilos,
Anaplasma
interfiere
con el
movimiento
de vesicular
para evitar
las lisosimas
Carece de receptor de transferrina
(TfR)antígeno temprano endosomal, Rab5, α-
adaptina
Carece de ATPasa tipo V
No adquiere marcadores lisosomales tardíos
como mieloperixidasa, CD63 y LAMP1
De esta forma evita la fusión con vesículas
secretoras y gránulos terciarios que contienen
componentes de la oxidasa de NADPH
TfR: Receptor de transferrina
LAMP1: Proteína asociada a lisosoma 1
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

A.
phagocytophilum
Adquiere
colesterol
Mediante el
aumento en los
receptores de LDL
Es incorporado a
la membrana de
Anaplasma
ER: retículo endoplásmico
Rab: proteínas de reciclado de endosomas

Respuesta inmune y
factores de virulencia

Escape de la actividad de neutrófilos
Los neutrófilos expresan recetores de superficie
reconocedores de patrones (PAMPs)
◦ Receptores tipo toll (TLR)
◦ Dominio de oligomerización de nucléotidos (NOD)
La unión a estos PAMPs
◦ inicia una gran respuesta inmune que generalmente concluye
en la eliminación del microorganismo,
A. phagocytophilum carece de los principales PAMPs
◦ LPS y peptodiglucanos
A. phagocytophilum “secuestra” factores de transcripción
y enzimas importantes en el reconocimiento bacteriano
TLR: receptores tipo Toll
NOD:: Dominio de oligomerizacion de nucleótidos
PAMPs: receptores reconocedores de patrones

PI – 3K: Fosfoinositol 3 kinasa
LYZ: lisosima
GNLY: Granulosina
DCD: Dermcidina
HNP: Pétido de neutrófilo humano
IRF – 1: Factor regulador de interferón 1
HDAC1: Deacetilasa de Histonas 1
DEFAS: Fefensina humana alfa 5
BPI: Proteína bactericida/de aumento de
permeabilidad

Disminución de las especies reactivas de O2
Neutrófilos y monocitos/macrófagos
◦ Mediadores del sistema de defensa dependiente
de ROS
En neutrófilos quiescentes, los componentes
de la NADPH oxidasa están desmantelados
◦ Al haber activación de los macrófagos, un
sistema de vesículas y gránulos específicos se
fusionan en las membranas del fagosoma
◦ Formando complejo citolítico de neutrófilos 1
(NCF1)
◦ Genera el ensamblaje de NADPH oxidasa
Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2012 May ; 35(3): 241–252
Clinical Science (2006) 111, 1–20

Disminución de las especies reactivas de O2
A. phagocytophilum no induce respuesta
mediada por ROS
No induce el ensamblaje de NADPH oxidasa
Clinical Science (2006) 111, 1–20

Inhibición de la apoptosis
A. phagocytophilum
◦ inhibe la apoptosis espontánea o inducida en
neutrófilos por 48 – 96 horas
◦ Dando tiempo para la replicación bacteriana
Aumenta la producción de bfl-1 de la familia de
proteínas antiapoptóticas bcl – 2
◦ Perdiendo la capacidad mitocondrial de activar la vía de
las caspasas
Otros mecanismos incluyen
◦ Inhibición de la activación de Fas
◦ Inhibición de la activación de procaspasa – 8

Manipulación de la autofagia
Varias señales distintivas de autofagia temprana
Se han encontrado en las inclusiones replicativas de
A. phagocytophilum
◦ LC3
◦ Beclina 1
La autofagia es necesaria para la replicación de A.
phagocytophilum
Ésta la favorece para remodelar el especio
citoplasmático
◦ Ganar mayor espacio para su propio crecimiento
Niu H. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012

Supresión de células TCD4+
La infección por A. phagocytophilum resulta
en una inmunosupresión generalizada
Caracterizada por leucopenia
• Linfopenia temprana
• Neutropenia y trombocitopenia en la infección
prolongada
Reducción de CD4+
• Regulación a la baja de la expresión del receptor de IL
– 2 , (CD24)
Trends Microbiol. 2016 Mar;24(3):173-80

Respuesta humoral
Mediada por citocinas
proinflamatorias,
especialmente
INF-δ
IL 10
In vitro, A.
phagocytophilum y la
proteína P44 induce la
expresión del mRNA de
IL-1B,
TNFα
IL-6
Varias interleucinas y sus
receptores se expresan
en macrófagos
expuestos a A.
phagocytophilum
TNF-,IL-1, IL-1ε, IL-6, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CCL3, CCL4,CCL20, CD54, IL-1RN, IL-1R1

Respuesta humoral
A. phagocytophilum carece de LPS y peptidoglucanos
Otras PAMPs deben estimular a los monocitos y la
respuesta inmune
• Lipoproteinas
• Proteínas de choque térmico
• Moléculas no identificadas

Contexto clínico
Infect Dis Clin N Am 29 (2015) 341–355

Frotis de sangre periférica
◦ Tinción Wright
◦ Giemsa
◦ Desde 20 – 100% se observan mórulas en el
citoplasma de los neutrófilos durante la primera
semana de la enfermedad

PCR
• Amplificación de DNA
• Alta especificidad 60 – 85%
• Alta sensibilidad 67 – 90%
• Muestras colectadas en citrato
de sodio o acido
etilendiamintetracetico
• Previos al inicio de tratamiento

Ticks and Tick-borne Diseases xxx (2014) xxx– xxx

Cultivo y aislamiento
◦ En células de leucemia HL – 60

Inmunohistoquímica
•Muestras fijadas en formol
•Previo al inicio de tratamiento o dentro de las
primeras 48 horas
•Biopsias de tejido, medula ósea o autopsias
(bazo, nódulos linfáticos, hígado, pulmón)

Pruebas serológicas
• Búsqueda de IgG o IgM mediante ensayos de inmunofluorecencia
indirecta (IFI)
• Gold estándar
• Pruebas seriadas durante 3 – 6 semanas
• La IFI para IgG es negativa hasta en 80% de los pacientes la primera
semana, la IFI IgM puede ser de poca utilidad en este periódo
• Reacción cruzada entre Ehrlichia y Anaplasma

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