LA COLORACION GRAM

1. INTRODUCCION
La identificación de muestras es esencial para la elaboración de estudios para ello se desarrollaron herramientas
de gran utilidad como el microscopio, el cual brinda la facilidad de entregar una imagen aumentada del objeto a
estudiar, para potenciar dicho beneficio se desarrollaron tinciones las cuales permiten una identificación de las
muestras observadas.
Las distintas tinciones pueden tener origen natural (extraídas de animales o plantas) y de origen químico
(minerales adulterados en laboratorio), sin importar el origen de las tinciones, su función principal es la de
resaltar estructuras y características del tejido, células y microorganismos. La coloración ZIEHL NEELSEN y
GRAM, las cuales permiten el reconocimiento de géneros específicos según los resultados de las tinciones sobre
las paredes celulares de la bacteria sometidas.
Para finalizar cada tinción posee un fundamento, el cual se basa en etapas, etapas en los cuales se agregan
reactivos o condiciones diferentes, y en dichas etapas que ocurre con las estructuras afectadas. Las etapas o
procesos más comunes en las tinciones microbianas constan de: Coloración primaria, mordiente y coloración
secundaria de contrastes.
La coloración Gram de gran importancia en microbiología porque permite diferenciar dos grupos de bacterias
(Gram + y Gram -), según se comporten ante este tinción. El fundamento radica en diferentes propiedades
estructurales de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram + tienen una gruesa capa de
peptidoglicano en su pared, mientras que las bacteria Gram – tienen una capa de peptidoglicano más fina y una
capa lipopolisacaridica externa, logrando la distinción con diferentes colorantes.
La tinción de Ziehl Neelsen (BAAR), es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, este
método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos
que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinción con
colorantes básicos. Por esta razón se denominan acido-alcohol resistente.

2. OBJETIVOS
 OBJETIVO GENERAL
 Conocer el fundamento de las diferentes coloraciones utilizadas en la observación
microscópica de microorganismos.
 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Aprender a preparar extendidos y coloraciones.
Aprender a observar en el microscópica los extendidos procesados.
Conocer y detectar las bacterias acido alcohol resistente mediante la tinción de Ziehl
Neelsen.
Aprender a diferenciar las bacterias Gram + y Gram - mediante la tinción Gram.
conocer los colorantes utilizados en la tinción gran y Ziehl Neelsen.
Conocer paso a peso el procedimiento utilizado en dichas tinciones.

3. I. MATERIALES Y MÉTODOS
1.1MATERIALES:
1.1.1COLORACION GRAM
 Microscopios compuestos binoculares.
 Agua .
 Hisopos
 Lámina portaobjetos.
 Muestra del sarro de la mucosa oral
 Pipeta
1.1.2 COLORACION ZIEHL NEELSEN:
 Guardapolvo.
 Microscopio compuesto binocular.
 Agua.
 Muestra del esputo de un paciente con TBC ya fijada en la lamina con
la coloración ziehl neelsen.
 Lámina portaobjetos.
 Piseta.
 Mechero bunsen.
1.2 REACTIVOS
1.2.1COLORACIÓN GRAM
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol-acetona
 Safranina
 Aceite de inmersión
1.2.2COLORACIÓN ZIEHL NEELSEN:
 Fucsina fenicada
 Alcohol acido

4.  Azul de metileno
 Aceite de inmersión
1.3. PROCEDIMIENTO:
1.3.1 COLORACIÓN GRAM
 Primero nos colocamos nuestros guardapolvos
 Luego sacamos el sarro del diente junto con la encía con la ayuda de
un hisopo girando de arriba hacia debajo.
 Después de eso hemos hecho un extendido a temperatura ambiente
y este tiene que ser homogéneo y fino en la lámina portaobjetos en
la que la muestra debe estar en el centro dejando unos márgenes de
0.5mm.
 Con la ayuda de un gotero dejamos caer unas cuantas gotas de
colorante cristal violeta quien es el colorante principal hasta cubrir el
extendido y se deja por 1 – 2 minutos. (imagen 2)
 Para eliminar el exceso de colorante inclinamos la muestra y
echamos un chorro de agua con una piseta. (imagen 3)
 Después de esto aplicamos el mordiente es decir el Lugol(contiene
yodo) quien ayuda a que la bacteria tenga una mejor fijación,
colorea mejor la célula
en un tiempo de un 1 minuto.(imagen 4)
 Luego hemos hecho el mismo procedimiento que en el anterior de la
eliminación del exceso de colorante.
 Después de hacer la eliminación de exceso de coloración provocamos
el punto crítico de la coloración al colocar el alcohol-acetona que
ayuda a un proceso de decoloración hasta que remueva todo el
colorante este permite hacer la diferenciación entre los GRAM(+)y los
GRAM(-).(imagen 5)
 Después de esto hacemos la eliminación del exceso del colorante, así
como en los casos anteriores.

5.  Luego hemos colocado la safranina que es un colorante de contraste
de color rojo quien da color rojo o fucsia a las GRAM(-). (imagen 6)
 Después de esto hemos enjuagado para sacar el exceso del colorante
como en los casos anteriores.
 Luego le hemos dejado secar a temperatura ambiente debido a que
es un preparado seco por ello debe estar seca la muestra.
 Después hemos empleado aceite de inmersión sobre la zona
coloreada ya que el uso del aceite de inmersión se basa en el
aprovechamiento en los lentes de aumento de 100x los cuales al
estar tan cerca de la muestra nos permite la entrada directa de la luz
haciendo que las muestras pequeñas se observen más fácil.
 Después de qué secó la muestra con la ayuda de nuestro docente lo
hemos colocado el preparado en seco sobre la platina.
 Luego hemos realizado la observación microscópica con objetivo de
inmersión a una magnificación objetiva de 100x.(imagen 6)
 Después cada estudiante nos hemos acercado a observar la muestra.
1.3.2 COLORACIÓN ZIEHL NEELSEN
 Primero nos colocamos nuestros guardapolvos
 Luego sacamos el sarro del diente junto con la encía con la ayuda de
un hisopo girando de arriba hacia debajo de ocho compañeros.
 Después de eso hemos hecho un extendido a temperatura ambiente
y este tiene que ser homogéneo y fino en la lámina portaobjetos en
la que la muestra se extiende por toda la lámina.
 Cubrir el extendido con colorante Fucsina Fenicada quien es el
colorante principal, hemos hecho un extendido por toda la lámina
por 5 minutos. (imagen 7)
 Después de esto hemos encendido el mechero bunsen y a este lo
hemos colocado por debajo de la lámina para calentarla hasta
desprender el primer humito, lo sacamos realizando tres veces este

6. mismo proceso evitando la ebullición esta técnica tiene como
nombre “tres humos”. (imagen 8)
 Después de esto hemos dejado enfriar un rato.
 Para eliminar el exceso de colorante inclinamos la muestra y
echamos un chorro de agua con una piseta. (imagen 9)
 Luego hemos colocado el decolorante llamado Alcohol – Acido hasta
quitar todo el colorante de la muestra. (imagen 10)
 Luego hemos colocado el azul de metileno que es un colorante de
contraste de color azul quien da color azul a las células epiteliales
para la diferenciación de las bacterias que se observan de color rojo
gracias a la fucsina fenicada.(imagen 11)
 Después de esto hemos enjuagado para sacar el exceso del colorante
como en los casos anteriores.
 Luego le hemos dejado secar a temperatura ambiente debido a que
es un preparado seco por ello debe estar seca la muestra.
 Después hemos empleado aceite de inmersión sobre la zona
coloreada.
 Después de qué secó la muestra con la ayuda de nuestro docente lo
hemos colocado el preparado en seco sobre la platina. (imagen 12)
 Luego hemos realizado la observación microscópica con objetivo de
inmersión a una magnificación objetiva de 100x.
 Después cada estudiante nos hemos acercado a observar la muestra.
(Imagen 13)
 Y también hemos observado la muestra de el esputo de un paciente
con TBC está ya estaba fijada en la lámina con la coloración Ziehl
Neelsen

7. II. RESULTADOS:
2.1 COLORACION GRAM
En primer lugar, se procedió a observar la placa que tenía la muestra del sarro
dental en la correspondía a los microorganismos llamados los cocos GRAM(+) que
se observaban de color violeta debido a estructura de la pared celular ya que esta
está compuesta de peptidoglicano y los ácidos teicoicos en la cual proporciona
estabilidad y forma al microorganismo en consecuencia el alcohol-acetona no lo
lava y por ello permanece con el color del colorante principal “cristal violeta”, en la
que se obtiene claramente la tinción
violeta que presentaron estas bacterias,
dispuestas en racimos, aunque también
se pueden encontrar en cadenas cortas
o diplococos.
También en la segunda muestra se procedió a observar la placa correspondiente a
los microorganismos GRAM (+) de color violeta en la que también se evidenciaban
bacilos color rojo y tres células epiteliales grandes.

8. En la tercera muestra hemos obtenido como resultado los microorganismos
GRAM(-) que tenían el color rosa ya que al tener la pared con bajo contenido de
peptidoglicano, que no suele sobrepasar el 5 al 10% de su peso, no pudieron
retener el cristal violeta y el alcohol – acetona lavó el color y esto ayuda a que
tenga el color de la safranina de color rojo o rosa por lo tanto permite hacer la
diferenciación entre GRAM(+) y GRAM(-)

9. 2.2 COLORACION DE ZIEHL NEELSEN
En la cuarta muestra que le correspondía al esputo de un paciente con TBC hemos
obtenido células epiteliales de color azul y el Mycobacterium tuberculosis de color rojo
debido a que el decolorante alcohol acido no lava al colorante primario y hay una mejor
fijación de la fucsina fenicada por lo tanto los microorganismos que se tiñan de un color
rojizo se les consideran ácido alcohol resistente positivos (AAR+).Al contrario, si los
microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante utilizado como el
decolorante alcohol acido en la cual toma el color del azul de metileno, se consideran
ácido alcohol resistente negativos (AAR-)

10. III. DISCUSION Y COMENTARIOS
3.1 COLORACIÓN GRAM
En la discusión de los resultados hemos observado la tinción de GRAM (+) de la
muestra del sarro dental debido a que la pared de los GRAM (+) posee una gruesa
capa de peptidoglicano además posee ácidos teicoicos . El cristal violeta penetró,
en esta célula, el Lugol hizo que el cristal violeta se fijara intensamente en la pared
bacteria de la célula y se formara un complejo entre los dos. El alcohol acetona
nos sirvió para realizar la decoloración, pero como esta es una bacteria positiva
esta no se descoloro a diferencia de la otra muestra de los GRAM (-) en este
procedimiento con el alcohol acetona estas se decoloran y por eso se usa la
safranina que es un colorante de contraste y podemos observar su color rojo. Esta
clase de bacteria pose una capa de peptidoglicano muy delgada.
La diferencia que se observó en la resistencia a la decoloración, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo
que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la
coloración azul-violácea. Pero, por el contrario, las Gram positivas, al poseer una
pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando
los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
3.2 COLORACION DE ZIHEL NEELSEN
En la discusión de los resultados en cuanto a la Tinción de Zhiel Neelsen que es
una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda realizar en
casi cualquier laboratorio. Esta tinción nos ha permitido diferenciar a las bacterias
en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-
ácido de aquellos que no lo son. Lo que hemos observado en esta práctica es la
bacteria de la tuberculosis llamada Mycobacterium tuberculosis que está

11. relacionado con géneros que contienen ácidos los cuales también pueden ser
teñidos con esta tinción por lo tanto la pared celular de las bacterias es
extremadamente compleja en cuanto a su composición bioquímica; dicha
característica es la que se hemos aprovechado para realizar esta tinción de Ziehl-
Neelsen ya que las paredes celulares esta bacteria contiene ácidos grasos que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la
tinción con colorantes básicos. Por esta razón se denominan ácido-alcohol
resistencia o AAR(+)En principio,lo que hemos observado son las bacterias
coloreadas de color rosado es el micobacterium tuberculosis , la que ha soportado
el alcohol – ácido sin decolorarse y a mantenido el color del colorante primario
que se les consideran ácido alcohol resistente positivos (AAR+) mientras que las
células de la mucosa oral lo hemos observado de color azul, , las cuales se
decoloraron con el alcohol – ácido y toman el color del azul metileno estas son
llamadas ácido alcohol resistentes negativos(AAR-)
COMENTARIOS: La coloración GRAM es de gran importancia ya que su utilidad
práctica es indiscutible en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de
Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos,
positivos, negativos, etc) las bacterias gram-positivas y gram-negativas se tiñen de
forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares y esto ayuda a poder nosotros diferenciarlos y así poder tener
una referencia adecuada para nuestra investigación por otro lado la coloración de
Ziehl Neelsen también es muy importante ya que es una técnica de tinción
diferencial rápida y económica, que se basa en que las paredes celulares de ciertos
parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de
cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las
micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como
Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia

12. IV.CONCLUSIONES:
Está práctica de tinción Gram y Ziehl Neelsen fue muy importante para mí como
estudiante y futuro profesional de la salud porque:
 Logré conocer el fundamento de las diferentes coloraciones utilizadas
en la observación del microscopio entender que la tinción de Gram y
la tinción Ziehl Neelsen es una herramienta útil en el laboratorio de
microbiología, así como en los análisis clínicos y diagnóstico médico.
 Aprendí a preparar extendidos y coloraciones, para luego ser
observadas en el microscopio.
 También aprendí a conocer y detectar las bacterias acido alcohol
resistente mediante la tinción Ziehl Neelsen. Me ayudó a comprender
que las bacterias difieren mucho químicamente esta diferencia
química es los que permite distinguir las bacterias por Tinción, puesto
que generalmente el colorante reacciona con la célula bacteriana,
pero no reacciona con su medio exterior produciendo un contraste.
 Por lo tanto aprendí a diferenciar las bacterias Gram + y Gram –
mediante la tinción Gram, ya que la tinción Gram permite el
correcto estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana,
como: paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares.

13. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS
 Anónimo, Tinción Ziehl Neelsen http://www.medical-labs.net/ziehl-neelsen-acid-fast-staining-
procedure-822.
 https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/
 https://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/discusioacuten.html
 https://www.clubensayos.com/Ciencia/PREPARACI%C3%93N-DE-UN-FROTIS-
BACTERIANO-Y-TINCI%C3%93N-DE/1171174.html
 https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/
 https://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/discusioacuten.html
 https://es.slideshare.net/machinmerino1/tinciones-diferenciales-tincion-gram-y-
tincion-ziehl-neelsen.

14. ANEXOS