Este documento presenta los métodos aceptados para realizar análisis microbiológicos del agua para consumo humano en Colombia. Describe el método para la detección e identificación de Cryptosporidium y Giardia a través de filtración, separación inmunomagnetica y análisis de inmunofluorescencia. El valor aceptable para ambos parásitos es cero organismos por volumen de muestra.

2. RESOLUCIÓN 2115 DE 2007
Capitulo III – Articulo 10
Técnicas aceptadas para realizar los análisis microbiológicos del agua para consumo humano
Deben ser validadas por el
Instituto Nacional de Salud, INS, o
revalidadas por este con base en
documentos
soporte
de
organismos internacionales que
presenten los solicitantes.
Giardia
y
Cryptosporidium
El valor aceptable es de cero (0)
Quistes y para Cryptosporidium
debe ser de cero (0) Ooquistes
por volumen fijado según la
metodología aplicada.
GENERALIDADES DEL METODO
Es un método desarrollado para la determinación, identificación y
concentración de Cryptosporidium y Giardia en matrices acuosas por
filtración , separación inmunomagnetica (IMS) y análisis por microscopia
de Inmunofluorescencia (FA) Giardia y Cryptosporidium se pueden
confirmar usando 4´6-diamidino-2 phenylindole (DAPI) que se tiñe y se
observa por microscopia diferenciada de contraste . Este método no
identificara las especies de Cryptosporidium o de giardia o las especies
del huésped de origen, ni puede determinar la viabilidad o la inefectividad
de quistes u Ooquistes detectados

3.  Protozoo flagelado.
 Pertenece al orden Diplomonadida.
 Parasita el tracto digestivo de humanos y otros
mamíferos, produciendo la patología giardiosis.
 Carecen de ciertos orgánulos como son las
mitocondrias y el aparato de Golgi.
 Alimentación por fagocitosis y pinocitosis.
 Reproducción por división binaria longitudinal.
SE PRESENTA EN DOS FORMAS
TROFOZOÍTO: Posee dos núcleos y cuatro pares
de flagéelos un disco suctorio (órgano de fijación) en
la mitad anterior de la superficie ventral.
QUISTE: ovoide, de 8 a 14 mm. de largo por 7 a 10
mm. de ancho, con 4 núcleos y el doble de
estructuras flagelares que el trofozoíto; es la forma
infectante.
Es un protozoario, parásito unicelular que viven
los intestinos de los animales y humanos.
Pertenece a la familia de los coccidios
Este patógeno microscópico causa una
enfermedad llamada criptosporidiosis
La forma inactiva del Cryptosporidium es el ooquiste,
El ooquiste tiene una estructura esférica o ligeramente
ovoidal que mide de 4 a 6micras de diámetro. Cuando
se observa con microscopía de contraste de fases se ve
que posee una doble pared y una estructura interna
formada por 4 esporozoitos vermiformes y cuerpos
residuales que no son claramente visibles. Esta pared lo
hace resistente por lo que puede sobrevivir bajo una
gran variedad de condiciones ambientales
Los Ooquistes de Cryptosporidium están presentes al menos en el 50% de las
aguas superficiales del mundo. Son los más resistentes de los patógenos
entéricos conocidos a los desinfectantes habituales en el tratamiento de agua
para consumo Las concentraciones habituales de cloro no son suficientes para
matar al organismo. Asimismo los quistes de Giardia (8-12 μm) y los ooquistes
de Cryptosporidium (4-6 μm) son bastante pequeños por lo que pueden no ser
eliminados durante la filtración.

4. EPA 1623
CONTEO STOCK
FILTRACION
CONTEO
SPIKE
ELUSION Y
CONCENTRACIÓN
IPR
SEPARACIÓN
INMUNOMAGNETICA
OPR
MS
TINCIÓN CON
INMUNOFLUORESCENCIA

5. Barómetro
Proceso que consiste en la separación de
Mide la
presión la
cual debe
estar entre
60-70 bares
o psi
uno o más elementos sólidos de un fluido,
mediante el paso de la mezcla a través de
un elemento poroso filtrante, llamado filtro
Totalizador
Se basa en la filtración de un volumen adecuado
de agua a través de un filtro de anillos de espuma
Mide la
cantidad de
agua que pasa
por el equipo
m3
comprimidos, con tamaño de poro de 1.2 micras
que permite la retención de Giardia y
Cryptosporidium presentes en la muestra
Rotametro
Housing
Base donde se
coloca el filtro
Mide el caudal de
agua filtrada

6.  ELUSIÓN. Consiste en una fase de lavado y
descompresión que se le hace al cartucho de
filtración con buffer PBST, en el cual quedaran
re suspendidas las partículas que fueron
filtradas.
CONCENTRACIÓN Esta etapa consiste en la
reunión de la mayor cantidad de partículas
suspendidas en el buffer de la elusión, pasando
por una membrana de nitrocelulosa con
diámetro
menor
a
1.2
micra
CENTRIFUGACIÓN:
Consiste
en
la
separación de partículas de diferentes
características teniendo en cuenta la densidad ,
sedimentando los sólidos o partículas de mayor
densidad en este caso son los Ooquistes de
Cryptosporidium y quistes de Giardia.

7. La separación Inmunomagnetica (IMS) utiliza perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos que
selectivamente atrapan los (oo)quistes de Cryptosporidium y Giardia. En esta etapa es importante el tiempo y
el movimiento del Dyal , ya que la rotación ayuda a la interacción de las perlas con los antigenos del parásitos.
Los anticuerpos ligados a las partículas se unirán de forma selectiva lo quistes/ooquistes formando unos
complejos. Dichos complejos se separan mediante un concentrador inmunomagnético (Dynal MPC). Los
desechos se descartan, resultando un pequeño volumen de muestra purificada que contiene los organismos.
Los parásitos son posteriormente disociados mediante un tratamiento ácido (Ácido clorhídrico) y de vórtex,
que rompen los lazos de los complejos, liberando los organismos e impidiendo la reorganización de estos.

8. Lectura de la muestra Cryptosporidium
FITC
Se debe emplear la ampliación de 200X
Se utiliza epifluorescencia para explorar el pozo
buscando formas de quistes y ooquistes de color verde
manzana. Buscar formas ovoides o esféricas de 4-6
um.
DAPI
Se debe emplear la ampliación de 400X.
Se usa el bloque UV del filtro para DAPI, el objeto debe
exhibir una de las siguientes características: a) una
coloración azul palida con un borde verde (DAPI -) , b)
que se tiña internamente de azul intenso (DAPI +), C) se
observan cuatro núcleos distintos, azul cielo (DAPI +).
DIC
Se debe emplear la ampliación de 1000X.
Se buscan características morfológicas internas y externas
anormales de los ooquistes (puntos, tallos, poros, núcleos,
esporas, cloroplastos, etc). Cuando no se observan estas
caracteristicas, se debe categorizar las formas: a) Un
ooquiste vacío de Cryptoposridium, b) un ooquiste de
Cryptosporidium con la estructura amorfa, c) un ooquiste
de Cryptosporidium con estrucutras internas.
Se debe registrar la forma, el tamaño (0.5 µm) y el
número de esporozoitos.
Lectura de la muestra Giardia
Se debe emplear la ampliación de 200X
Se observa luz fluorescente verde brillante alrededor de
los objetos ovales (de 8-18 µm de largo por 5-25 de
ancho).
Se debe emplear la ampliación de 400X.
Se usa el filtro para DAPI, el objeto debe exhibir una
de las siguientes características: a) coloración interno
azulada (ningún núcleos distintivo y un borde verde
(DAPI -) , b) Coloración interna azul intenso (DAPI +),
C) se observan dos o cuatro núcleos distintos, azul
cielo (DAPI +).
Se debe emplear la ampliación de 1000X.
Se buscan características morfológicas internas y externas
anormales de los ooquistes (puntos, tallos, poros, núcleos,
esporas, cloroplastos, etc). Cuando no se observan estas
caracteristicas, se debe categorizar las formas: a) Un quiste
vacío de Giardia, b) un quiste de Giardia con la estructura
amorfa, c) un quiste de Giardia con un tipo de estructura
interna (núcleos, cuerpo mediano o axonemas), d) Un quiste
de Giardia con más de un tipo de estructura interna.
Se debe registrar la forma, el tamaño (0.5 µm) y el número
de núcleos y presencia del cuerpo medio o los axonemas.

9. Sobre un porta depositamos una
muestra en la que buscamos la
presencia de un determinado antígeno.
Añadimos un suero específico del
antígeno problema marcado con
isotiocinato
de
fluoresceína
(conjugado). Si el antígeno problema
se encuentra presente en la muestra,
se une el conjugado. En caso contrario
el conjugado se elimina con un lavado
del
porta.
La lectura se hace con un microscopio
de fluorescencia cuya luz excita a una
longitud de onda de 490-520 nm al
isotiocianato de fluoresceína haciendo
que emita luz fluorescente de color
verde. La observación de luz verde
fluorescente “tiñendo” un objeto del
porta indica la presencia del antígeno
en la muestra

10. Es un colorante fluorescente
que pertenece al grupo de los
colorantes de indol. Se usa
para la tinción de ADN, para
tinción nuclear, para la tinción
de células vivas y para la
contratinción en tinciones
inmunofluorescentes.
Para la determinación de
(oo)quistes, este colorante
presenta tropismo por la
cromatina y se excita a una
longitud de 450-470 nm (uv)
Giardia
Cryptosporidium

11. La microscopia de interferencia o técnica DIC (DiffentialInterference Contrast) Nomarski, permite la visualización de
especímenes mucho más densos gracias a que la imagen
proyectada es tridimensional, es decir, permite observar las
estructuras externas e internas anormales de un microorganismo.