mecanismos de resistencia microbianos

3. ENZIMAS B-LACTAMASAS
La producción de β-lactamasa es el principal mecanismo de resistencia a β-lactamicos en
microorganismos gramnegativos. La introducción de las cefalosporinas de tercera generación en la
práctica clínica a principios de los años 80 fue anunciada como un gran avance en la lucha contra la
resistencia bacteriana mediada por β-lactamasa a los antibióticos. Estas cefalosporinas se han
desarrollado en respuesta a la mayor prevalencia de β-lactamasas en ciertos microorganismos (por
ejemplo, β-lactamasas TEM-1 y SHV-1 en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae hidrolizando
ampicilina) y la propagación de estas β-lactamasas en nuevos huéspedes (por ejemplo, Haemophilus
influenzae y Neisseria gonorrhoeae ).
Las Enzimas B-lactamasas, hidrolizan irreversiblemente el enlace amida del núcleo batalactámico,
transformándola en compuesto inactivo incapaces de ejercer su acción antimicrobiana y confieren
resistencia bacteriana a las penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda, tercera y cuarta
generación y aztreonam (pero no a las cefamicinas o carbapenemes) . A su vez estas enzimas
pueden ser inhibidos por los inhibidores de B- lactamasas como el ácido clavulánico. Para el
propósito de esta revisión, el término BLEE se entenderá como aquellas β-lactamasas del grupo 2be
de Bush-Jacoby-Medeiros y las del grupo 2d que comparten la mayoría de las propiedades
fundamentales de las enzimas del grupo 2be.

6. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LOS B-LACTÁMICOS

8. CLASIFICACIÓN DE LAS B- LACTAMASAS
 Las β-lactamasas se clasifican más comúnmente de acuerdo con dos esquemas generales: el esquema de
clasificación molecular de Ambler y el esquema de clasificación funcional de Bush-Jacoby-Medieros. El
esquema de Ambler divide las β-lactamasas en cuatro clases principales (de la A hasta la D). La base de este
esquema de clasificación se basa en la homología de proteínas (similitud de aminoácidos), y no en las
características fenotípicas. En el esquema de clasificación de Ambler, las β-lactamasas de las clases A, C y D
son serina β-lactamasas. Por el contrario, las enzimas de la clase B son metalo-β-lactamasas. El esquema de
clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros agrupa las β-lactamasas según las similitudes funcionales (sustrato y
perfil inhibidor). Hay cuatro grupos principales y múltiples subgrupos en este sistema. Este esquema de
clasificación es de una relevancia mucho más inmediata para el médico o microbiólogo en un laboratorio de
microbiología porque considera a los inhibidores de β-lactamasa y sustratos de los β-lactamicos clínicamente
relevantes.
 La designación 2be muestra que estas enzimas se derivan de las β-lactamasas del grupo 2b (por ejemplo,
TEM-1, TEM-2 y SHV-1); El e de 2be denota que las β-lactamasas tienen un espectro extendido. Las enzimas
del Grupo 2b hidrolizan penicilina y ampicilina, y en menor grado carbenicilina o cefalotina. No son capaces de
hidrolizar cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam en ningún grado significativo.

9. clasificación molecular de Ambler y esquema de clasificación funcional de Bush-
Jacoby-Medieros

10. TIPOS DE β-LACTAMASES DE ESPECTRO EXTENDIDO
1. TIPO SHV
Las BLEE de tipo SHV fueron los que se encontraron al inicio más frecuentemente en los aislamientos clínicos que cualquier otro tipo de BLEE
2. TIPO TEM
Las BLEE de tipo TEM son derivadas de TEM-1 y TEM-2. TEM-1 se informó por primera vez en 1965 de un aislamiento de Escherichia coli de un
paciente en Atenas, Grecia, llamado Temoneira (de ahí la designación TEM). TEM-1 es capaz de hidrolizar la ampicilina a una velocidad mayor que
la carbenicilina
3. TIPO CTX-M
En 1989, un aislamiento clínico de E. coli que producía un BLEE no-TEM, no SHV se recuperó y la Enzima fue designada como CTX-M-1
4. TIPO GES
La enzima GES-1 se describió inicialmente en un aislamiento de K. pneumoniae de un paciente neonatal recién trasladado a Francia desde la
Guayana Francesa (de allí el nombre).nzima fue designada CTX-M-1, denotando su actividad hidrolítica frente a Cefotaxima
5. TIPO OXA
Las β-lactamasas OXA son clasificados en la clase D en el esquema de Ambler y fueron colocados en el grupo 2d en el esquema funcional de Bush-
Jacoby-Medeiros. Las enzimas OXA tienen más del 50% de actividad hidrolítica contra cloxacillina u oxacilina comparado con el de bencilpenicilina y
variable perfil de Inhibición por inhibidores de β-lactamasas.
6. TIPO PER
Las BLEE de tipo PER comparten sólo alrededor del 25 al 27% de homología con BLEE conocidas de tipo TEM y SHV. La β-lactamasa PER-1
hidroliza eficientemente penicilinas y cefalosporinas y es susceptible a la inhibición del ácido clavulánico. La enzima PER-1 fue primero detectado en

11. DETECCIÓN DE BLEE EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
La detección de microorganismos que portan BLEE proporciona a los clínicos información útil. Tratamiento de
infecciones causados ​​por microorganismos productores de BLEE con cefalosporinas de espectro extendido o
aztreonam puede dar lugar fracasos en el tratamiento, incluso cuando los microorganismos causantes de la
infección parecen sensibles a estos agentes antimicrobianos por la pruebas de susceptibilidad rutinaria
(antibiograma). Además, los pacientes colonizados o infectados con un microorganismo productor de ESBL
deberían ser colocados bajo precauciones de contacto para evitar la transmisión hospitalaria. Estos beneficios
justifican la detección de microorganismos en los laboratorios de microbiología.
IDENTIFICACIÓN
El fundamento de la detección es enfrentar las bacterias en estudio con los preparados batalactámicos, para
poner en evidencia la mayor o menor estabilidad de estos frente a las betalactamasas. Los métodos usados
varían según la especie a estudiar, el antibiótico a ensayar y el tipo de enzima a detectar.

14. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE BLEE RECOMENDADO POR LA CLSI
La CLSI recomienda el tamizaje de E. coli, K. pneumoniae, y Klebsiella oxytoca (y Proteus mirabilis, si es
clínicamente relevante tal como aislamientos bacteriémicos) para la producción potencial de BLEE. El método
CLSI para la detección de BLEE consiste en una detección de 2 pasos
a) Prueba de tamizaje inicial
b) Prueba fenotípica confirmatoria

15. a) PRUEBA DE TAMIZAJE INICIAL
Las susceptibilidades a más de uno de los siguientes antibióticos, cefpodoxima, ceftazidima, Ceftriaxona, cefotaxima y
aztreonam son evaluados usando el método de disco difusión o caldo dilución en la prueba de tamizaje inicial. Una disminución
de las susceptibilidades a una o más antibióticos probados puede indicar la producción de BLEE y justifica realizar la
subsiguiente prueba de Confirmación Fenotípica. Cabe señalar que los valores de MIC inferiores a los puntos de corte para la
susceptibilidad son aplicados para la prueba de tamizaje inicial. Por ejemplo, MIC ≥ 2 μg/mL para ceftazidima es considerado
como positivo en la prueba de tamizaje inicial, mientras que MIC ≤ 8 µg/mL es el rango de susceptible para
Enterobacteriaceae.

16. B-PRUEBA FENOTIPICA CONFIRMATORIA
 En la Prueba Confirmativa Fenotípica, las susceptibilidades a Cefotaxima y ceftazidima sola, y
Cefotaxima y ceftazidima con clavulanato se comparan usando el método de disco difusión o
caldo dilución. Si la susceptibilidad de cualquiera de los antibióticos ensayos incrementa
significativamente (un incremento ≥ 5 mm en la zona de diámetro o una disminución de ≥ 3
diluciones en el MIC) en presencia de ácido clavulanico, el resultado es interpretado como
confirmativo de la producción de BLEE. Es importante realizar las pruebas confirmatorias
usando ceftazidima y cefotaxima para mejorar la sensibilidad de la prueba. Un reporte sugiere
que el uso de la ceftazidima sola conduce a la inadvertencia de la producción de BLEE tipo
CTX-M.

17. PRUEBA FENOTIPICA CONFIRMATORIA

18.  PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO
La prueba de sinergia de doble disco (DDST) fue el primer método de prueba propuesto para la detección fenotípica de
microorganismos productora de BLEE. El DDST se realiza en una placa de agar Mueller Hinton con un disco que contiene
cefotaxima (30μg) y un disco que contiene Amoxicilina/clavulanico (20 µg/10 µg, respectivamente), colocados a 30 mm de
distancia (centro a centro). Un aumento en la zona de inhibición alrededor del disco de cefotaxima hacia el disco
Amoxicilina/clavulanico indica la producción de BLEE. Los discos conteniendo otros oximino-β-lactamicos (ceftriaxona,
Ceftazidima, o aztreonam) puede ser sustituido por el disco de cefotaxima y el rendimiento de esta prueba usando múltiples
oximino-cefalosporinas mejora la sensibilidad del DDST de la misma manera como es observado en el método CLSI.

20. DETECCION DE LA RESISTENCIA EN ENTEROBACTERIAS A
CEFALOSPORINAS DE TERCERA GENERACION: β-lactamasas AmpC
Las β-lactamasas AmpC pertenecen al grupo 1 de la clasificación funcional de Bush-Jacoby- Medeiros y a la
clase C de la clasificación estructural de Ambler. Se caracterizan por ser activas frente penicilinas y
cefalosporinas, pudiendo hidrolizar cefamicinas (cefoxitina y cefotetan), oximinocefaloporinas (ceftazidima,
cefotaxima y ceftriaxona) y monobactams (aztreonam) con la excepción de cefalosporinas de cuarta generación
(cefepima, cefpiroma) y carbapenémicos. Estas enzimas se caracterizan por ser resistentes a la combinación
de β-lactámico con inhibidores de β-lactamasas (amoxicilina/clavulanico), con la posible excepción de
piperacilina-tazobactam. Este espectro de hidrólisis puede verse ampliado (subgrupo 1e) y afectar a las
cefalosporinas de cuarta generación como resultado de sustituciones, inserciones o delecciones aminoacídicas
en seis regiones de la enzima, son las llamadas AmpC de espectro extendido, ESAC.
Las AmpC constituyen otro tipo de β-lactamasas que, a diferencia de las BLEE, no poseen en la actualidad un
método estandarizado por el Instituto de Estándares de Laboratorios Clínicos (CLSI), para su detección
fenotípica. Este hecho, aunado a la dificultad para dilucidar fenotípicamente si se está en presencia de una
AmpC cromosómica o plasmídica, y a la carencia de inhibidores de AmpC para uso in vivo, hacen considerar a
estas enzimas como un emergente problema terapéutico.

22. CLASIFICACION DE LAS β-LACTAMASAS AmpC SEGÚN LOCALIZACION Y
EXPRESION DEL GEN ampC
 a) AmpC cromosómicas inducibles
 Ciertas enterobacterias poseen de manera natural (cromosomico) betalactamasas tipo AmpC, tal es el caso
de Enterobacter spp., Providencia spp., Morganella morganii, Serratia marcescens, Citrobacter freundii y
Hafnia alvei; al igual que bacilos gramnegativos no fermentadores de importancia clínica como Pseudomonas
aeruginosa, entre otras. Se producen a bajos niveles y aumentan su síntesis en presencia de inductores
(betalactámicos). Pueden derreprimirse, perdiendo así la característica de inducción. Entre los betalactámicos
ampicilina, imipenem y cefoxitina aun en baja concentración, son fuertes inductores de betalactamasas
AmpC. Sin embargo, imipenem y cefoxitina son los más estables a la enzima, no asi la ampicilina que es labil
a la enzima. Las cefalosporinas de segunda y tercera generación, ureidopenicilinas y monobactámicos son
inductores débiles de la enzimas y ademas son lábiles a la enzima AmpC.


23. CLASIFICACION DE LAS β-LACTAMASAS AmpC SEGÚN LOCALIZACION Y
EXPRESION DEL GEN ampC

25.  MÉTODO DE DETECCIÓN FENOTÍPICA DE BETALACTAMASAS AMPC INDUCIBLE
En el laboratorio se puede aplicar una prueba para la detección de β-lactamasas AmpC inducibles en
Enterobacter spp., Providencia spp., Morganella morganii, Serratia marcescens, Citrobacter freundii y Hafnia
alvei;. Importante recordar que el problema en estos microorganismo no es la inducibilidad,ya que son inducible
de manera natural, sino la derrepresion que puede ocurrir durante el tratamiento con cefalosporinas de tercera
generacion.
Método de aproximación de discos: (Propuesto por Sanders y Sanders)
La técnica consiste en realizar un antibiograma convencional, para luego colocar un disco de cefoxitina o
cualquier otro antimicrobiano inductor a una distancia de 25 mm de centro-centro de un disco de ceftazidima,
ceftriaxona o cefotaxima (antimicrobiano sustrato, revelador o testigo). El microorganismo producirá una
betalactamasa inducible si se observa un halo de inhibición truncado (achatado) del antimicrobiano sustrato,
testigo o revelador.

26.  Métodos de sinergia de doble disco
 En este método se usan discos de cloxacilina 500 μg, discos de cefotaxima y ceftazidima evaluando la
distorsión de la zona de inhibición entre los discos. La técnica consiste en inocular la cepa en estudio en
placas con agar Mueller-Hinton según métodos convencionales, para luego colocar un disco de
cloxacilina (500μg) y a ambos lados, discos de ceftazidima (30μg) y cefotaxima (30μg) a una distancia
de 25 mm de centro a centro. Un aumento del halo de inhibición de las cefalosporinas adyacente a la
cloxacilina, se interpreta como prueba positiva para la producción de AmpC.

29. ACIDO BORÓNICO COMO INHIBIDOR DE AMPC
 La detección de AmpC también puede llevarse a cabo mediante estos dos métodos utilizando
ácido borónico y sus derivados.
Métodos de sinergia de doble disco
 En este método se usan discos de acido fenil borónico 300 μg, discos de cefotaxima y ceftazidima
evaluando la distorsión de la zona de inhibición entre los discos. La técnica consiste en inocular la
cepa en estudio en placas con agar Mueller-Hinton según métodos convencionales, para luego
colocar un disco de ácido fenil borónico (300μg) y a ambos lados, discos de cefotaxima (30μg) y
ceftazidima (30μg) a una distancia de 25 mm de centro a centro. Un aumento del halo de
inhibición de las cefalosporinas adyacente al acido fenil borónico, se interpreta como prueba
positiva para la producción de AmpC.