Este documento presenta información sobre la detección y clasificación de mecanismos de resistencia a antibióticos β-lactámicos en bacterias gramnegativas, incluyendo β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), AmpC y metalo-β-lactamasas. Describe pruebas de laboratorio como el uso de inhibidores y diluciones seriadas para identificar estos mecanismos. También compara los nuevos criterios CLSI 2010 para la interpretación de sensibilidades antimicrobianas.

1. ACTUALIZACION EN
RESISTENCIA BACTERIANA Y
NORMAS CLSI 2010
Detección de Resistencia en
Bacterias Gram negativas
María Victoria Ovalle
Bacterióloga

2. Mecanismo de Resistencia a los
antibióticos β lactámicos
Impermeabilidad: porinas
Bombas de Eflujo

3. Mecanismo de Resistencia a los
antibióticos β lactámicos
PBP: Poco usual
Producción de enzimas: Más común

4. Resistencia Natural
Germen R. Natural R. Inusual
E. coli -- Col, Imi, Me
Klebsiella spp Amp, Ti Col, Imi, Me
Proteus mirabilis Col, Te, C Imi, Me
Proteus vulgaris
Col, C1G, Te, Amp,
CXM Imi, Me
Enterobacter spp Amp, FOX, AMC,C1G Col, Imi, Me
Serratia spp
Amp, AMS, C,CXM,
C1G Imi, Me

5. β lactamasas
Las β-lactamasas son enzimas catalíticas
que rompen el enlace amídico del anillo
betalactámico haciendo que el
antibiótico pierda su capacidad para
unirse a las proteínas de unión a la
penicilina y su acción bactericida

6. Clasificación de β lactamasas
Clase Molecular
Bush-Jacoby -Medeiros
(2009) Substrato
Inhibido
por
AC ó TZ
Inhibido
por
EDTA
A (serina
penicilinasa)
2a Penicilina Si No
2b
Penicilina y cefalosporinas de corto
espectro Si No
2be
Penicilina y cefalosporinas de espectro
corto y espectro extendido Si No
2br Penicilina No No
2ber
Cefalosporinas de espectro extendido,
monobactam No No
2c Carbecilina Si No
2ce Carbecilina, Cefepime Si No
2e Cefalosporinas de espectro extendido Si No
2f Carbapenemes Variable No
B (metalo β-
lactamasas
3a Carbapenemes No Si
3b Carbapenemes No Si
C (cefalosporinasas)
1 Cefalosporinas No No
1e Cefalosporinas No No
D (oxacilinasas)
2d Cloxacilina Variable No
2de Cefalosporinas de espectro extendido Variable No
2df Carbapenemes Variable No
No clasificadas 4
Karen Bush* and George A. Jacoby.Antimicrob agents and chemotherapy.2010, 54 (3); 969–976

7. β-lactamasas de espectro ampliado (grupo
2b) (Enzimas TEM-1,TEM-2 y SHV-1)
Hidrolizan la penicilina y ampicilina y en menor grado
a carbecilina ó cefalotina.
No son capaces de hidrolizar las cefalosporinas o
aztreonam y son inhibidas por el acido clavulánico.

8. β-lactamasas de espectro extendido - BLEE
Clase A(2be)
Enzimas: (SHV-2 a SHV-6, TEM-3 a TEM-26, CTX-M)
Las BLEE derivadas de TEM-1, TEM-2 ó SHV-1 difieren
en aa.
Hidrolizan cefalosporinas de amplio espectro, de
tercera generación, antibióticos monobactámicos y
puedan ser inhibidas por el acido clavulánico

9. β-lactamasas de espectro extendido - BLEE
CLSI
Según PK/PD se establecieron nuevos criterios de
interpretación para cefalosporinas
Antimicrobiano
Criterios de Interpretación
CLSI 2010
Criterios de Interpretación
CLSI 2009
Difusión en disco
(mm)
Concentración
Inhibitoria Mínima
µg/mL
Difusión en disco
(mm)
Concentración
Inhibitoria Mínima
µg/mL
S I R S I R S I R S I R
Cefotaxima ≥ 26 23-25 ≤ 22 ≤ 1 2 ≥ 4 ≥ 23 15-22 ≤ 14 ≤ 8 16-32 ≥ 64
Cefriaxona ≥ 23 20-22 ≤ 19 ≤ 1 2 ≥ 4 ≥ 21 14-20 ≤ 13 ≤ 8 16-32 ≥ 64
Ceftazidima ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 4 8 ≥ 16 ≥ 18 15-17 ≤ 14 ≤ 8 16 ≥ 32
Ceftizoxima ≥ 25 22-24 ≤ 21 ≤ 1 2 ≥ 4 ≥ 20 15-19 ≤ 14 ≤ 8 16-32 ≥ 64
Aztreonam ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 4 8 ≥16 ≥ 22 16-21 ≤ 15 ≤ 8 16 ≥ 32

10. Equipos automatizados Vs nuevos criterios
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Antimicrobiano
Criterios Interpretación
Diluciones Concentración Inhibitoria Mínima
µg/mL
Vitek MicroScan Phoenix
Cefotaxima 1,4,16,32 2,8,16,32 4,8,16,32
Ceftazidima 1,2,8,32 1,4,8,16 0,5, 1,2
Antimicrobiano
Concentración
Inhibitoria Mínima
µg/mL
Concentración Inhibitoria
Mínima µg/mL
CLSI 2009 CLSI 2010
S I R S I R
Cefotaxima ≤ 8 16-32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥ 16

11. Equipos automatizados Vs nuevos criterios
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Antimicrobiano
Criterios Interpretación
Diluciones Concentración Inhibitoria Mínima
µg/mL
Vitek MicroScan Phoenix
Cefotaxima 1,4,16,32 2,8,16,32 4,8,16,32
Ceftazidima 1,2,8,32 1,4,8,16 0,5, 1,2
Antimicrobiano
Concentración
Inhibitoria Mínima
µg/mL
Concentración Inhibitoria
Mínima µg/mL
CLSI 2009 CLSI 2010
S I R S I R
Cefotaxima ≤ 8 16-32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥ 16

12. Equipos automatizados Vs nuevos criterios
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Antimicrobiano
Criterios Interpretación
Diluciones Concentración Inhibitoria Mínima
µg/mL
Vitek MicroScan Phoenix
Cefotaxima 1,4,16,32 2,8,16,32 4,8,16,32
Ceftazidima 1,2,8,32 1,4,8,16 0,5, 1,2
Cefriaxona 2,4,8,16,32
Antimicrobiano
Concentración
Inhibitoria Mínima
µg/mL
Concentración Inhibitoria
Mínima µg/mL
CLSI 2009 CLSI 2010
S I R S I R
Cefotaxima ≤ 8 16-32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥ 16

13. β lactamasas de espectro extendido
CLSI
Cuando se usan los nuevos criterios de
interpretación, la prueba de rutina de BLEE no es
necesaria realizarla. (No se editan resultados).
Sin embargo hasta que el laboratorio implemente
los nuevos criterios, la prueba de BLEE puede ser
realizada como recomienda CLSI.

14. Detección de BLEE por el Laboratorio
Tamizaje Resultados
Ceftriaxona 30µg ≤
≤
≤
≤ 25 mm
Cefotaxima 30µg ≤
≤
≤
≤ 27 mm
Ceftazidima 30µg ≤
≤
≤
≤ 22 mm
Aztreonam 30µg ≤
≤
≤
≤ 27 mm
Sospecha de BLEE
Test Confirmatorio Resultado
Ceftazidima 30µg
Ceftazidima + AC 30/10µg
≥
≥
≥
≥ 5 mm BLEE
Cefotaxima 30µg
Cefotaxima + AC 30/10µg

15. Detección de BLEE por el Laboratorio
Tamizaje Resultados
Ceftriaxona 1µg/mL ≥ 2 µg/mL
Cefotaxima 1µg/mL ≥ 2 µg/mL
Ceftazidima 1µg/mL ≥ 2 µg/mL
Aztreonam 1µg/mL ≥ 2 µg/mL
Cefpodoxima 4µg/mL ≥ 8 µg/mL
Sospecha de BLEE
Test Confirmatorio Resultado
Ceftazidima 0.25-64µg/mL
Ceftazidima + AC 0.25/4-64/4µg/mL 3 ó más Dlnes
BLEE
Cefotaxima 0.25-128µg/mL
Cefotaxima + AC 0.25/4-128/4µg/mL

16. Detección de BLEE por el Laboratorio
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia

17. Otras Pruebas para la detección de BLEE por el
Laboratorio
Prueba Doble Disco
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia

18. Otras Pruebas para la detección de BLEE por el
Laboratorio
Prueba E test
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia
Laboratorio Universidad Nacional de Colombia

19. β-lactamasas AmpC Clase C (grupo 1)
Enzimas AmpC: CMY-2, ACT-1, FOX
También conocidas como cefalosporinasas
Codificadas en cromosoma y unas pocas en plásmidos.
Estas enzimas no son inhibidas por ácido clavulánico
Son activas frente a cefalosporinas , cefamicinas,
aztreonam e Inhibidores

20. β-lactamasas AmpC Clase C (grupo 1)
Enzimas: AmpC, CMY-2, ACT-1
AmpC cromosómica Inducible:
- Bajos niveles de AmpC -Inducción β lactámicos
- Hiperproducción AmpC Ej Enterobacter spp
AmpC cromosómica no inducible:
- Niveles bajos -Hiperproducción AmpC Ej E. coli
AmpC Plasmídica: R variable al Azt Ej K. pneum

21. Detección de AmpC por el Laboratorio
CLSI no tiene estandarizada la detección de AmpC
por el Laboratorio.
Prueba de Disco para AmpC
Disco EDTA liberación de β lactamasa
Disco de FOX
E. coli ATCC 25922
Sensibilidad 100%, especificidad 98%
Black J et al. J Clin Microbiol. 43:3110-3113.

22. Detección de AmpC por el Laboratorio
Test Tridimensional
Cultivo en caldo a partir
de 0.5 McFarland
Concentración de células
E. coli ATCC 25922
Disco FOX
Hendidura en el agar
Coudron P, et al. J Clin Microbiol. 38:1791-1796.

23. Detección de AmpC por el Laboratorio
Prueba con Agar suplementado con FOX
Agar con FOX diferentes
concentraciones
Extracto celular
E. coli ATCC 25922
Pozo con extracto celular
Nasim K, Et all. J Clin Microbiol. 2004 Oct;42(10):4799-802.

24. Detección de AmpC por el Laboratorio
Prueba con acido borónico
Acido borónico entre CTX y CAZ
Resultado: Sinergia
Beesley et al
CAZ, CTX y CAZ/APB, CTX/APB
Resultado positivo: Ampliación del halo +5mm
Pasteran et al

25. CASO No.1
Paciente varón de 78 años con litiasis biliar y colecistectomía, ha presentado varios
episodios de colangitis (Infección del conducto colédoco).
Acude a urgencias con fiebre de 3 días de evolución. Se tomó hemocultivo y líquido biliar
para cultivo, de los cuales se aisló E. coli.
El antibiograma por el laboratorio arrojo los siguientes resultados:
REPORTE DE LABORATORIO
Antibiótico Interpretación
Cefazolina R
Ceftazidima R
Cefotaxima I
Cefepime S
Aztreonam I
Piperacilina I
Imipenem S
Meropenem S
1. Que mecanismo de resistencia puede presentar el microorganismo?
Que prueba haría para confirmarlo?

26. CASO No.1
Respuesta No.1
El resultado del antibiograma sugiere una resistencia a
cefalosporinas de I y III generación y resistencia a
monobactam, lo cual podría generar sospecha de la
presencia de betalactamasas de espectro extendido ó
AmpC.
Se realizaría la prueba confirmatoria de BLEE
recomendada por CLSI.

27. CASO No.1
La prueba confirmatoria de BLEE dio el siguiente resultado:
2. Como interpretaría esta prueba y que mecanismo de resistencia está
implicado en este caso?
3. Que pruebas adicionales podría utilizar en el laboratorio para confirmar
este mecanismo?

28. CASO No.1
Respuesta No.2 y 3
RESPUESTA 2. Al realizar la prueba tamiz de BLEE y
observar que no amplia con acido clavulánico, podría
sugerir la presencia de AmpC.
RESPUESTA 3. Podría realizarse si el laboratorio lo desea la
prueba de disco AmpC, test tridimensional, disco con
acido borónico.
Probar la resistencia a cefoxitin, ya que es predictor de
AmpC.

29. Detección de Metalo β-lactamasas Clase B (grupo 3)
Enzimas: IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII , GIM
Denominadas metalo β-lactamasas (MBLs)
Hidrolizan carbapenemes, β lactámicos y los
inhibidores de β-lactámicos como acido
clavulánico y tazobactam. No aztreonam
Susceptible a la inhibición de agentes quelantes
como EDTA, acido mercaptoacético y acido
mercaptopropiónico (MPA).
Dependiente de Zinc

30. Detección de metalo β lactamasas por el
Laboratorio
CLSI no tiene estandarizada la detección
de metalo β lactamasas por el
Laboratorio.
E test
Tira con Imipenem e Imipenem/EDTA
Reducción ≥3 diluciones en presencia de
EDTA es positivo para MBLs
Falsos positivos P.aeruginosa
y A. baumannii
Timothy R. Walsh,et al. J Clin Microb. 20025. 40(8): 2755-2759

31. Detección de metalo β lactamasas por el
Laboratorio
Prueba de Sinergismo
Suspensión del microorganismo
0.5 McFarland
Dos discos de imipenem y
meropenem
Se adiciona EDTA
Varios agentes quelantes
Sinergia
Sanchez A, et al. Rev Esp Quinioterap. 2004;17(4):336-340.

32. Detección de β lactamasas tipo Oxacilinasa Clase D
(grupo 2d) OXA-1, OXA-10
Las β-lactamasas tipo OXA son enzimas dependientes
de serina.
β-lactamasas de espectro amplio: penicilinas y
cefalosporinas
β-lactamasas con espectro de hidrólisis expandido:
cefalosporinas de espectro extendido y carbapenemes
No son inhibidas por el Ac. Clavulánico
Inhibidas por NaCl

33. Detección de β lactamasas tipo Oxacilinasa
por el Laboratorio
CLSI no tiene estandarizada la detección de β
lactamasas tipo OXA por el Laboratorio
Literatura recomienda análisis
espectrofotométricos con extractos celulares
en presencia de NaCl.
Pruebas Moleculares

34. Como reconozco?
BLEE
Neta R a cefalotina
Sensibilidad Imi, Mer
Amplia con acido clavulánico
Sensible a FOX
Afecta la CIM de penicilina, C1,2, 3 y 4G y Azt

35. Como reconozco?
AmpC
Neta R a cefalotina
Sensibilidad Imi, Mer
Resistencia ó sensibilidad disminuída a FOX
CIM de Aztreonam y C3G (nivel bajo de R)
C4G sensible

36. Detección de β lactamasas tipo Carbapenemasas
Clase A (grupo 2f) Enzimas: IMI, SME y KPC
Enzimas que hidrolizan carbapenemes,
cefalosporinas, penicilinas y aztreonam.
Son inhibidas por el clavulánico y tazobactam.
Se encuentran en Enterobacter cloacae,
Serratia marcescens y K. pneumoniae.
También en no fermentadores como P.
aeruginosa.

37. Detección de β lactamasas tipo Carbapenemasas
Clase A (grupo 2f) Enzimas: IMI, SME y KPC
Sistemas automatizados presentan
limitaciones en la detección de
carbapenemasas
Imipenem es afectado por el inóculo

38. Detección de β lactamasas tipo Carbapenemasas
Clase A (grupo 2f) Enzimas: IMI, SME y KPC
CLSI
Enterobacterias resistentes a una ó más
cefalosporinas de III generación (CIM elevada ó
reducida zona inhibición a carbapenemes)
“puede ser un aislamiento productor de
carbapenemasa”, a pesar de estar dentro del
rango de susceptible

39. Detección de β lactamasas tipo Carbapenemasas
Clase A (grupo 2f) Enzimas: IMI, SME y KPC
Antibiótico Difusión en disco
(mm)
Microdilución en
caldo
(µg/mL)
Imipenem -- 2-4
Meropenem 16-21 2-4
Ertapenem 19-21 2
Prueba tamiz

40. Detección de β lactamasas tipo
carbapenemasas por el Laboratorio
Prueba Confirmatoria “Test de Hodge”
E. coli ATCC 25922
Disco ertapenem ó meropenem
Estría del microorganismo
Laboratorio de Microbiología Universidad Nacional

41. Detección de β lactamasas tipo
carbapenemasas por el Laboratorio
CLSI REPORTE POR EL LABORATORIO
Los aislamientos positivos con el Test de Hodge pero
susceptibles a carbapenemes:
Reportar CIM de los carbapenemes sin interpretación “Estos
aislamientos demostraron producción de carbapenemasas. La
eficacia clínica de los carbapenemes no ha sido establecida
para el tratamiento de infecciones causadas por
Enterobacteriaceae donde las pruebas para carbapenemes
(ertapenem ≤2µg/mL, meropenem e imipenem ≤4µg/mL)
fueron sensibles, pero demostraron producción de
carbapenemasa in vivo”

42. Detección de β lactamasas tipo
carbapenemasas por el Laboratorio
CLSI REPORTE POR EL LABORATORIO
Los aislamientos negativos con el Test de
Hodge:
Reportar el dato de la CIM de los
carbapenemes de acuerdo a los criterios de
interpretación de CLSI.

43. Otras Pruebas para la detección de β lactamasas
tipo carbapenemasas por el Laboratorio
Prueba sinergismo con doble disco y acido borónico
Suspensión del microorganismo al 0.5 McFarland
Discos de imipenem, meropenem ó ertapenem y acido
borónico
Sinergia
Pasteran F, et al. J. Clin. Microbiol. 2009 June47(6):1631-1639

44. Otras Pruebas para la detección de β lactamasas
tipo carbapenemasas por el Laboratorio
Prueba con acido borónico
Suspensión del microorganismo al 0.5 McFarland
Discos de imipenem, meropenem ó ertapenem
Acido borónico inhibidor reversible de enzima KPC
Incremento ≥5mm
Pasteran F, J. Clin. Microbiol. 2009 June47(6):1631-163

45. CASO No.2
Mujer de 45 años, VIH-positiva, fue ingresada por absceso del tubo ovárico. Durante el
procedimiento quirúrgico se tomó muestra del líquido peritoneal y se aislaron 2 fenotipos
de Klebsiella pneumoniae. Al realizar las pruebas de susceptibilidad por difusión en disco
se obtuvo el siguiente reporte para los dos fenotipos:
1. Que le sugieren a usted los resultados del antibiograma para los dos reportes?
2. Se requiere una prueba confirmatoria para el reporte No.1? En caso de ser una respuesta positiva
cual prueba realizaría para confirmarlo?
3. Se requiere una prueba confirmatoria para el reporte No.2? En caso de ser una respuesta positiva
cual prueba realizaría para confirmarlo?
REPORTE DE LABORATORIO
Aislamiento No 1
Antibiótico (mm)/Interpretación
Ceftazidima 15(R )
Cefotaxima 19 (R )
Cefepime 12( R)
Ceftriaxona 16(R)
Imipenem 21 (S)
Meropenem 18 (S)
Ertapenem 19 (S)
REPORTE DE LABORATORIO
Aislamiento No.2
Antibiótico Interpretación
Ceftazidima 15 (R )
Cefotaxima 19 (R )
Cefepime 12( R)
Ceftriaxona 16(R)
Imipenem 6 (R )
Meropenem 8 (R )
Ertapenem 10 (R )

46. CASO No.2
Respuesta No.1, 2 y 3
RESPUESTA 1. El reporte 1, se observa sensibilidad a carbapenemes, de acuerdo a los
rangos sugeridos por CLSI como sospechosos de carbapenemasa, debemos sospechar de la
presencia de una carbapenemasa
El reporte 2, de acuerdo a los halos de los carbapenemes se observa una franca resistencia.
Las carbapenemasas son enzimas capaces de hidrolizar todos los antibióticos beta-
lactámicos incluyendo carbapenemas como imipenem, meropenem y ertapenem.
RESPUESTA 2. Si se requiere una prueba confirmatoria ya que los halos sugieren una
sospecha de carbapenemasa. Se realizaría la prueba de Hodge.
RESPUESTA 3. No se requiere una prueba confirmatoria porque CLSI recomienda “No es
necesario probar un aislamiento para carbapenemes realizando el test de Hodge, cuando
todos los carbapenemes reportados por el laboratorio son intermedios o resistentes.

47. CASO No.2
El laboratorio realizo la prueba de Hodge para el aislamiento 1(C)
obteniéndose el siguiente resultado
1.Control Negativo
2.Control Positivo
3.Aislamiento estudiado
4. Como reportaría el aislamiento 1 y 2 al clínico? Realizaría algún cambio en
el reporte?

48. CASO No.2
Respuesta No.4
RESPUESTA 4. El reporte 1 da una prueba de Hodge positiva. Se
reportan los carbapenemes sin la interpretación con el siguiente
comentario:
“ Este aislamiento demuestra producción de carbapenemasas. La
eficacia clínica de los carbapenemes no ha sido establecida para el
tratamiento de infecciones causadas por Enterobacteriaceae donde
las pruebas para carbapenemes (ertapenem ≤2µg/mL, meropenem
e imipenem ≤4µg/mL) fueron sensibles, pero demostraron
producción de carbapenemasa in vivo”
Para el reporte 2 se debe informar las CIM de los carbapenemes con
la interpretación de criterios de acuerdo a CLSI.

49. Resistencia a Quinolonas
Mecanismo de acción
Ingreso a la célula: Porinas
Sitio de acción: DNA girasa (Gram neg)
Topoisomerasa IV (Gram pos)
Efecto: Cambio en el enrollamiento DNA
Mecanismo de Resistencia
Alteración sitio blanco del AB
Reducción permeabilidad
Eflujo

50. Detección de Resistencia a Quinolonas
CLSI
Aislamientos de Salmonella spp susceptibles a
fluoroquinolonas y con una prueba a acido nalidixico
resistente pueden estar asociados con fracaso clínico ó
respuesta tardía en pacientes tratados con fluoroquinolonas
con salmonelosis extrainstestinal. “aislamientos
extraintestinales de Salmonella extraintestinal pueden ser
probados para determinar resistencia a acido nalidixico”

51. Resistencia en Pseudomonas aeruginosa
Mecanismo de Resistencia
Impermeabilidad (OprD)
Bombas de eflujo: MEXAB-OprM (R a mer)
β lactámicos, C, quinol, Te, SXT
MEXXY-OprM (S a mer)
Resistencia en P. aeruginosa
BLEE (PSE) R Tic y Pip
Carbapenemasas adquiridas (MBLs)
AmpC

52. Detección de Resistencia en Psedomonas aeruginosa
CLSI
Retira la recomendación de adicionar un comentario al
reporte en la parte de penicilinas, sugiriendo la adición de un
segundo agente antimicrobiano (ej fluoroquinolona,
aminoglucósidos) para infecciones con P. aeruginosa

53. Resistencia en Acinetobacter spp
Mecanismo de Resistencia
Impermeabilidad (CarO)
Bombas de Eflujo
Resistencia en Acinetobacter
BLEE (tipo OXA)
Carbapenemasas (VIM, IMP)
Cefalosporinasas (CAZ R)

54. Stenotrophomonas maltophilia
Patógeno oportunista
Brotes Hospitalarios
Uso de AB de amplio espectro

55. Resistencia en Stenotrophomonas maltophilia
Mecanismo de Resistencia
Impermeabilidad
Bombas de eflujo
Resistencia en Stenotrophomonas maltophilia
β lactamasas inducibleL1: R a amp, R Inh β lactámicos,
R carbap, S aztreonam
β lactamasas L2 inducible: R a amp y azt, S a carbap e
inh β lactámicos