Este documento presenta las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de bacterias, incluyendo pruebas como la producción de indol, hidrólisis de urea, descarboxilación de lisina, producción de sulfuro de hidrógeno, hidrólisis de gelatina y reducción de nitratos. Explica los fundamentos, materiales y procedimientos para cada prueba, con el objetivo de identificar bacterias a nivel de género y especie. También incluye un cuestionario sobre los fundamentos de los procesos desc

1. Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias
UNIVERSIDAD
NACIONAL PEDRO
RUIZGALLO
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias
INTEGRANTES:
• Chuga Neciosup Alonso Aldayr
• Pérez Ortega Gabriela
• Ríos Puelles Diego Arturo
• Salazar Farro Nicole
DOCENTE:
• MSc. Mario C. Moreno Mantilla.
CICLO:
VI
CURSO:
MICROBIOLOGIA GENERAL
07 de marzo del 2022 Chiclayo, Lambayeque. Perú

2. I. INTRODUCCION:
Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos convencionales,
basados en las características fenotípicas, puesto que su realización y coste los hace más
asequibles. Los métodos genotípicos suelen reservarse para las bacterias que no se pueden
identificar con métodos convencionales. Los esquemas tradicionales de identificación
fenotípica bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como su
morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas. El cultivo, cuando es
factible, continúa siendo el método diagnóstico de elección; permite el aislamiento del
microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos
y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. En el cultivo es esencial la correcta
elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación. En el proceso de
identificación bacteriana tradicional, la experiencia del microbiólogo es fundamental para la
elección de una prueba o una batería de pruebas de forma secuencial, en función de la
fiabilidad de las mismas, del género o de la especie bacteriana que se pretende identificar, del
origen del aislado bacteriano, así como del coste de las mismas. Los laboratorios deben
elaborar y realizar un proceso de identificación normalizado en su actividad diaria, que utilice
de forma secuencial o simultánea un conjunto de pruebas cuyo propósito final sea la
identificación del microorganismo a nivel de género y especie y que incluya la mayoría de
las bacterias desde el punto de vista infeccioso.
II. OBJETIVOS:
• Conocer las diferentes técnicas de identificación bacteriana.
• Identificación de las principales bacterias que pueden encontrarse en muestras clínicas
y pretende ser una guía detallada del proceso de identificación
III. MATERIALES:
• Materiales inertes
✓ Portaobjetos
✓ Cubreobjetos
✓ Colorantes
✓ Asa bacteriológica
✓ Microscopio
• Materiales biológicos

3. o Caldo triptonado:
✓ Triptona 15,0 g
✓ Cloruro de sodio 5,0 g
✓ Agua destilada 1000,0 mL
o Reactivo Kovac:
✓ Para-dimetil-aminobenzaldehído 10,0 g
✓ Alcohol amílico o isoamílico 150,0 mL
✓ Ácido clorhídrico concentrado 50,0 mL
IV.METODOLOGIA Y RESULTADOS
✓ Producción de Indol
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir indol a
partir del triptófano.
Fundamento:
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano
y esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas
denominadas en su conjunto triptofanasas.Para detectar la producción de indol se utiliza el
medio Caldo triptófano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de Kovacs
(alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado) con el
que el indol producido reacciona generando una coloración rosa intensa.
Materiales:
• Caldo triptonado:
✓ Triptona 15,0 g
✓ Cloruro de sodio 5,0 g
✓ Agua destilada 1000,0 mL
• Reactivo Kovac:
✓ Para-dimetil-aminobenzaldehído 10,0 g
✓ Alcohol amílico o isoamílico 150,0 mL
✓ Ácido clorhídrico concentrado 50,0 mL
Procedimiento:
✓ El medio de cultivo líquido se inocula introduciendo en él una carga de bacterias de la cepa en
estudio mediante el asa bacteriológica.
✓ Se incuba a 37ºC durante 24 horas y tras la incubación, añadimos unas gotas de reactivo de
Kovacs.
✓ Si se ha producido indol aparecerá un anillo rosa fucsia en la superficie del caldo de cultivo.

4. ✓ Hidrolisis de Urea
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la
urea, formando dos moléculas de amoníaco por la acción de la enzima ureasa.
Fundamento:
En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el
indicador de pH. El agar es el agente solidificante. Las bacterias hidrolizan la urea por medio
de la enzima ureasa liberan amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el
medio de cultivo haciendo virar el indicador rojo de fenol del color amarillo al rojo.
Materiales:
✓ Caldo urea
✓ Extracto de levadura 0,1 g
✓ Fosfato monopotásico 9,1 g
✓ Fosfato disódico 9,5 g
✓ Urea 20,0 g
✓ Rojo fenol 0,01 g
✓ Agua destilada 1000,0 mL
Procedimiento:
Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro proveniente de un medio sólido.
Incube a 35°C por 24 horas.
Una reacción positiva (hidrólisis de la urea) es indicada por un cambio de color del amarillo
(pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o más alcalino).

5. ✓ Descarboxilación de la Lisina
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir una
enzima que descarboxila el aminoácido lisina.
Fundamento:
Algunas bacterias poseen unas enzimas decarboxilasas específicas que son capaces de atacar
el grupo carboxilo de determinados aminoácidos, produciendo anhídrido carbónico y una
amina, o diamina. Así la lisina decarboxilasa (LDC) produce, a partir de la L – lisina:
cadaverina (una diamina) y CO2. La ornitina decarboxilasa (ODC) por acción sobre su L –
aminoácido específico da putresceína (diamina) y CO2.
Materiales:
✓ Caldo Lisina
✓ Peptona 5,0 g
✓ Extracto de levadura 3,0 g
✓ Glucosa 1,0 g
✓ Lisina 5,0 g
✓ Púrpura de bromocresol 0,02 g
✓ Agua destilada 1000,0 mL
Procedimiento:
✓ Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro al caldo lisina. Cubra los
tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de parafina estéril. Incube a 35°C por 24
horas.
✓ Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar
el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la
descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la cual neutralizará el ácido
producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su color original
violeta.

6. ✓ Producción de Sulfuro de hidrógeno:
Esta producción de H2S se ve producido por la actividad de las bacterias sobre ciertos
aminoácidos que suelen contener azufre. Esto se hace cuando se emplean sales de metales
pesados como lo podría ser el hierro. Esta producción va a dar una coloración negruzca, esto
debido al ácido sulfhídrico con dichos metales.
➢ Cepas Bacteriana
✓ Salmonella entérica
✓ Shigella sonnei
➢ Medios de Cultivo: SIM
✓ Peptona caseína …20g
✓ Peptona de carne …6.1g
✓ Sulfato de hierro y amonio …0.2g
✓ Tiosulfato de sodio …0.2g
✓ Agar …3.5g
➢ Procedimiento:
✓ Primero se inocula una de las diapos del medio SIM por picadura en el centro
✓ Se debe incubar a 37°C durante 24h en aerobiosis
➢ Resultados:
✓ Si es positivo, la muestra se ennegrecerá
✓ Si es negativo, no habrá una variación
✓ Hidrólisis de Gelatina:
La gelatina se puede hidrolizar con algunas enzimas proteolíticas como la gelatinasas, las
cuales presentan ciertas bacterias

7. ➢ Cepas Bacteriana
✓ Staphylococcus aureus
✓ Escherichia coli
➢ Medio de Cultivo: Medio Fraizer
✓ Peptona …10g
✓ Cloruro de sodio …5g
✓ Extracto de carne …5g
✓ Gelatina …4.8g
✓ Agar …15g
✓ Agua destilada …1000ml
✓ pH …7.2
➢ Procedimiento
✓ Primero se siembra por puntura las muestras de S. aureus y E. coli en palcas con
Agar gelatina
✓ Luego se incuban las placas a 37°C durante 48-72h
✓ Posteriormente se agrega la solución de HgCl2
✓ Reducción de Nitratos:
Algunas bacterias pueden reducir los nitritos a ciertos productos gaseosos como N o N2O, estos
nitritos pueden ser obtenidos de los nitratos que han sido reducidos previamente en nitritos. Se
usa esta prueba para lograr detectar una respiración anaerobia, utilizando nitrato como aceptor
final de electrones.
➢ Cepas Bacteriana
✓ Salmonella entérica
✓ Shigella sonnei
➢ Reactivos:
✓ Solución A
- Solución Acética de Ácido sulfanífilico al 0.8%
✓ Solución B
- Solución acética de naftil amina al 0.5%
➢ Medios de Cultivo: Caldo Nitrato
✓ Peptona …10g
✓ NaCl …5g
✓ KNO3 …1g
✓ Agua destilada …1000ml
✓ pH …7.2

8. ➢ Procedimiento:
✓ Primero se siembra una cepa de E. coli y de Acinetobater Baumanni en tubos con
caldo nitrato; utilizar para ello la aguja bacteriológica
✓ Luego se agregan 3 gotas del reactivo A y 3 gotas del reactivo B
V.CUESTIONARIO:
1. Fundamento de los procesos de arriba
Fundamento la prueba de indol es un ensayo cualitativo utilizado para diferenciar
microorganismos en base a la capacidad para separar indol a partir de l-triptofano. (Expósito,
2011).
Fundamentos del método: La ureasa descompone específicamente la urea produciendo dióxido
de carbono y amoníaco. Este reacciona en medio alca- lino con salicilato e hipoclorito para dar
indofenol color verde. (Quintero, 2003).
Descarboxilación de la Lisina: En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura
aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los
indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador
de pH (su color es amarillo a pH igual o menor a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y el
agar es el agente solidificante. (López, 2008).
Producción de Sulfuro de hidrógeno: La actividad de las bacterias sobre aminoácidos que
contienen azufre, frecuentemente produce liberación de sulfhídrico, lo cual se demuestra
empleando sales de metales pesados como el hierro. El sulfhídrico reacciona con tales metales
dando una coloración oscura al medio de cultivo. (Benítez, 2008).
Hidrólisis de Gelatina: Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un
microorganismo para producir enzimas proteolíticas que licúan la gelatina (gelatinasas).
Reducción de Nitratos: Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen
los nitritos a productos gaseosos (N2 y N2O). Las enzimas responsables de
ambas reducciones se denominan nitrato y nitrito reductasa, respectivamente. La prueba
detecta nitritos en los cultivos con reactivos que originan una coloración roja. (Cabrera, 2003).
2. Describir la formulación del reactivo de Ehrlich
La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los
Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio
por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la
presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.

9. El reactivo de Ehrlich es un líquido que se utiliza para hacer pruebas de colorimetría y detectar
la presencia de determinadas sustancias en muestra. El reactivo en particular reacciona con la
molécula de indol, la cual está presente en las triptaminas. (Mesa, 2014).
Su preparación consiste en mezclar 1 ml del líquido sobrenadante con 1 ml del reactivo de
Ehrlich (3.3) con la ayuda de una pipeta aforada de 1 ml. Utilizar un agitador para asegurar
que la mezcla sea homogénea. Dejar reaccionar la mezcla 5 minutos antes de medir la
absorbancia.
Este reactivo está realmente formado por la mezcla de ácido clorhídrico concentrado y el de
p-dimetilamino benzaldehído. (Mesa, 2014).

10. VI. REFERENCIAS:
✓ Baggini, S. P. (2014, 21 julio). GUÍA PRACTICA DEL LABORATORIO
MICROBIOLOGICO DE AGUAS Y ALIMENTOS (PARTE 8). SEGURIDAD
ALIMENTARIA, BROMATOLOGÍA y MICROBIOLOGÍA de los ALIMENTOS.
https://bagginis.blogspot.com/2014/07/guia-practica-del-laboratorio_21.html
✓ Sanchez, J. (2015, 9 junio). PRUEBAS BIOQUÕMICAS DESCARBOXILASA LISINA Y
MEDIO SIM. Prezi.Com. https://prezi.com/eg3fnwsdmfqw/pruebas-bioquimicas-
descarboxilasa-lisina-y-medio-sim/
✓ Gurrola, S. (2014, 10 abril). Pruebas bioquímicas. Slideshare.
https://es.slideshare.net/SusanaGG/pruebas-bioqumicas
✓ Jimenez, A. (2010). Microbiología de la producción controlada de sulfuro de
hidrógeno. una experiencia de trabajo en el laboratorio de educación secundaria.
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✓ Química. Raymond Chang. McGraw-Hill, 2003.
✓ Gonzales, L. (2014). Utilidad de la prueba del nitrato reductasa para la detección rápida
de resistencia en Mycobacterium tuberculosis.
http://www.scielo.org.co/pdf/bio/v34s1/v34s1a26.pdf
✓ Mesa Herrera, Natalia Regina & Carmona Carmona, Cristian Andrés & Burgos
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producidos en los errores innatos del metabolismo. Iatreia, 27 (4),417-427.[fecha de
Consulta 6 de Marzo de 2022]. ISSN: 0121-0793. Disponible en:
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✓ Expósito Boué, Lourdes M., & Bott Croublet, Ana Belkis, & de la Torre Rosés, Iliana,
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