1) El documento describe los métodos para diagnosticar la enfermedad causada por Corynebacterium diphtheriae mediante el análisis de muestras de garganta, nariz y piel. 2) Incluye información sobre cómo tomar y procesar las muestras, así como sobre las pruebas de cultivo, tinción y toxigenicidad para identificar C. diphtheriae. 3) También describe la prueba de Schick, la cual permite determinar la susceptibilidad a la difteria mediante una reacción intradermal con toxina difté

1. Método Diagnostico
Corynebacterium Diphtheriae

2. Muestra
Para el diagnóstico etiológico de la enfermedad
respiratoria se requieren muestras de
hisopados de fauces y nasofaríngeos y/o trozos de
membrana.
Si se sospecha difteria cutánea las muestras
deben ser de piel, garganta y nasofaríngea.
Los hisopos utilizados para la toma de muestras
son los habituales: hisopos estériles con punta
de algodón, dacrón o alginato de calcio.

3. Toma de la Muestra

4. La faringe debe estar claramente visible y
bien iluminada.
Deprimir la base de la lengua con baja
lengua e hisopar la garganta, sin tocar saliva
ni
mucosas laterales.
Frotar vigorosamente cualquier membrana,
o área inflamada, presionando ligeramente
con
el hisopo y ejerciendo un movimiento de
rotación.
Si existe alguna membrana, levantar el
borde e hisopar por debajo de la misma,
para
acceder a los microorganismos diftéricos
localizados más profundamente. Es
recomendable, además, enviar un trozo de
membrana.
Realizar extendidos en 2 portaobjetos.
Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la
coloración de Gram y la coloración de azul de
metileno de Löeffler.

5. - Hisopado Nasofaríngeo
Insertar el hisopo flexible de alambre de
cromo o acero inoxidable en la nariz, a través
del
orificio nasal, más allá de la parte anterior de
la narina.
Introducir suavemente el hisopo en la nariz
hasta encontrar resistencia a nivel de los
cornetes (no debe utilizarse la fuerza para
salvar algún tipo de obstrucción).
Rotar el hisopo sobre la mucosa nasal.
Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar
secar al aire y fijar por calor. Realizar la
coloración de Gram y la coloración de azul de
metileno de Löeffler.

6. Muestra Cutánea
Limpiar con solución salina estéril y
remover el material adherido a la
lesión.
Presionar el hisopo firmemente
dentro de la misma.

7. Cultivo

8. MEDIOS DE CULTIVO
Medio Agar Sangre Cistina
Telurito (ASCT).
Medio Löeffler (ML). Se
aconseja para la observación
de la morfología bacteriana.
Agar Sangre (AS).
Caldo Todd Hewitt (CTH)
con 3 % de sangre.

9. Frotis

10. - Coloración de Gram
Bacilos pleomórficos gram positivos, dispuestos en forma de letras
chinas y en empalizada,
posibles formas cocobacilares, más predominantes en cultivos viejos.
Los frotis directos de garganta
muestran mucho menos pleomorfismo; los microorganismos son
generalmente más cortos y se
tiñen más uniformemente que los cultivados

11. Coloración de Azul de Metileno de
Löeffler
Bacilos rectos o levemente curvos, frecuentemente, se
deforman en forma de clavas en uno o
ambos extremos y no se tiñen con uniformidad sino que
muestran gránulos (metacromáticos color
rojo púrpura) o barras que se colorean más profundamente.
Pueden mostrar diversas formas: en
clava, granular, en barra, en cuña y de coloración intensa.

12. Colonias

13. Aspecto de las Colonias
Medio Agar Sangre Cistina Telurito
Corynebacterium diphtheriae reduce
el telurito del medio a telurito
metálico, el cual precipita y
produce el desarrollo de colonias
negras, gris acero, de 1 a 3 mm de
diámetro

14. Aspecto de las Colonias
Medio Agar Sangre Cistina Telurito
Corynebacterium diphtheriae reduce el
telurito del medio a telurito metálico, el cual
precipita y
produce el desarrollo de colonias negras, gris
acero, de 1 a 3 mm de diámetro

15. - Medio de Löeffler
Luego de 24 horas de incubación a 37 ºC, las colonias tienen alrededor de
1mm de diámetro y
son circulares, de superficie lisa y borde entero. Son cremosas, fácilmente
emulsionables en agua o
solución fisiológica y convexas, con centro ligeramente elevado. Después
de 48-72 hs. de
incubación, las colonias se agrandan, el centro se hace más elevado y la
periferia sigue siendo plana
y más transparente que el centro.

16. - Medio Agar Sangre
C. diphtheriae var. intermedius: más pequeñas, planas,
cremosas, transparentes, no
hemolíticas.
C. diphtheriae var. mitis y C. diphtheriae var. gravis: más
grandes, convexas, débil beta
hemólisis.

17. - Medio Agar Tinsdale
Este medio de cultivo se utiliza para la detección de la
enzima cistinasa y es de utilidad para la
identificación presuntiva de C. diphtheriae.

18. El medio agar Tinsdale contiene telurito y cistina. La cistinasa
produce sulfuro de hidrógeno a
partir de la cistina, el cual reacciona con el telurito formando un
“halo marrón difuso” alrededor
de una colonia negra, luego de incubar a 37 ºC durante 24-48 hs.
Otras especies de corinebacterias
pueden dar colonias negras, pero sin la formación del halo
marrón

19. Prueba de Toxigenicidad: Método de
Inmunoprecipitación de Elek
En el agar se deben observar líneas blancas de precipitación, que
aparecen aproximadamente a
10 mm del borde de la tira de papel de filtro, formando un ángulo de
45º, respecto de la línea de
crecimiento. Estas bandas indican que la toxina producida, por el
aislamiento en estudio, ha
reaccionado con la antitoxina homóloga

20. La aparición de líneas de precipitación, en forma de arco entre el control
positivo y la cepa cuya
toxicidad se está probando, indican que ésta es productora de toxina. Las
cepas no toxigénicas no
forman líneas de precipitación.
Después de 48 horas de incubación, pueden aparecer líneas de
precipitación inespecíficas,
debido a otros antígenos solubles que pueden ser producidos por cepas
toxigénicas y no toxigénicas,
por lo cual la placa no debe incubarse más de 48 horas.

21. Pruebas especificas

22. La reacción de Schick
La prueba de Schick es un procedimiento que permite
determinar si un individuo es susceptible de
padecer difteria, al valorar el grado de respuesta inmune
del sujeto contra Corynebacterium diphtheriae,
patógeno responsable de la enfermedad.1 Esta prueba,
recibe su nombre del pediatra húngaro, aunque
nacionalizado estadounidenseBéla Schick (1877–1967),
que desarrolló esta técnica entre 1910 y 1911
Es una intradermoreaccion con toxina difterica que permite
detectar la presencia de anticuerpo neutralizantes
La lectura se la realiza a los 4 o 5 días y la presencia de Edema
con necrosis refleja la ausencia de anticuerpos neutralizados