Este documento describe la técnica de microscopía de fluorescencia y cómo se utilizó para estudiar la localización subcelular de la proteína JAK3 y su forma fosforilada (pY980-JAK3) en linfocitos T CD4+ de pacientes sanos e infectados con VIH. La microscopía de fluorescencia permitió observar por primera vez la presencia de JAK3 en el núcleo de las células, y que aunque la infección por VIH no afecta su localización, la forma fosforilada es más

1. Unité d’Immunogenétique Cellulaire, Département Infection et Epidémiologie et Département
d’Immunologie, Institut Pasteur, Paris,
France.

2. Es un microscopio óptico, la luz que
incide sobre la muestra estudiada no la
atraviesa sino que el mismo lente
ilumina y recibe la luz emitida por la
muestra. Su funcionamiento se basa
en la propiedad de fluorescencia que
tienen ciertas moléculas denominadas
fluorocromos.
Los fluorocromos son sustancias que tienen
la propiedad de emitir un fotón de una
longitud de onda determinada cuando son
excitados por un fotón incidente de una
longitud de onda característica.

3. Fuente de emisión
Filtro de Excitación
Filtro de
barrera
Espejo dicroico
Muestra
1. La lámpara emite luz en
todo el espectro
2. El filtro de excitación
sólo deja pasar la parte del
espectro necesaria para
excitar la muestra
3. El espejo dicroico refleja
hacia la muestra la excitación
correspondiente.
4. La muestra se excita con la luz que le
llega y emite en un espectro superior al
de la excitación.
5. El espejo dicroico transmite
la emisión de la muestra
6. El filtro barrera hace una selección exacta
del espectro de emisión que nos interesa.

4. Filtro de excitación:
selecciona la luz de la
longitud de onda
incidente.
Espejo dicroico: refleja la
luz de ciertas longitudes
de onda mientras que
deja pasar la luz de
longitudes de onda
mayores.
Filtro de emisión o
barrera: selecciona la
longitud de onda
fluorescente emitida por
el fluorocromo
permitiendo que llegue
hasta los oculares.
Objetivos: Pata obtener
una intensidad de la
señal óptima se debe
emplear una apertura
numérica elevada y el
menor aumento posible.

5. Fluorocromos utilizados::
• Anticuerpo de conejo anti-JAK3
• Anticuerpo de conejo anti-
pY980-JAK3
• Anticuerpo ratón anti-CD4
• DAPI

6. CD4
Dapi
JAK3
Localización nuclear de
JAK3 en los linfocitos CD4.
Cada celda está representada con y sin núcleo
Dapi y, con y sin etiquetado CD4 para visualizar
mejor la presencia de JAK3 en el núcleo y
citoplasma.

7. CD4
Dapi
pY980-JAK3
Localización nuclear de JAK3
fosforilada en los linfocitos CD4.
Cada celda está representada con y sin núcleo
Dapi y, con y sin etiquetado CD4 para visualizar
mejor la presencia de JAK3 fosforilado en el
núcleo y citoplasma.

8. La microscopía de fluorescencia se aplica a la determinación cuantitativa de aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos y muchos fluorocromos celulares.
Este tipo de técnica ha sido importante en el estudio de señalización de enfermedades como el SIDA.
Por primera vez, se muestra localización nuclear de JACK3.
El JAK3 se observa en su ubicación subcelular en cantidades comparables, en los núcleos de los linfocitos CD4 de
pacientes sanos e infectados porVIH.
El estudio demostró que la infección porVIH no afecta la localización nuclear de JAK3.
Se demostró que la JAK3 fosforilada es mas abundante en los núcleos de las células T CD4+ de los pacientes
virémicos, y puede estar implicado en la patogénesis de la infección.