Este documento describe un experimento para extraer y determinar la actividad biológica de lectinas (proteínas) de semillas de diferentes especies vegetales. El objetivo general es adquirir conocimientos sobre la obtención de compuestos proteicos con actividad hemoaglutinante a partir de extractos vegetales. Se realizarán pruebas de hemoaglutinación para determinar la actividad de los extractos y el método de Bradford para cuantificar las lectinas. El SDS-PAGE se utilizará para confirmar los pesos moleculares de las lectinas obtenidas.

1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA FARMACÉUTICA
Práctica 3. Extracción y determinación de actividad biológica de
una proteína (lectinas)
Integrantes:
 Acosta Rodríguez María Fernanda
 Ayllón Ornelas Brenda Karen
 FierroLeos Ariadna
 González Hernández Luisa Fernanda
 Mendoza Narez René
Profesoras:
 M. en C. Flor Selene Villalobos Escobedo
 Dra. Estela Flores Gómez
Fecha de entrega: 14/03/2022
Equipo 1 Grupo: 5FM2

2. Práctica 3. Extracción y determinación de actividad biológica de una proteína (lectinas)
Objetivos
Objetivogeneral
 Adquirirlosconocimientosteórico-prácticosparalaobtenciónde compuestosproteicoscon
actividad hemoaglutinante a partir de extractos vegetales.
Objetivos específicos
 Determinarlaactividadhemoaglutinante de diferentesextractosde lectinasde semillasde
diferentes especies vegetales.
 Determinarcuantitativamente lacantidadde lectinasencadaextractoa travésdel método
Bradford.
 Confirmar los pesos moleculares de las lectinas obtenidas mediante el uso de geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE).
Metodología
Extracción de lectinas
Prueba de hemoaglutinación

3. Tabla 1. Fundamentosde losreactivosutilizadosenlapráctica3
Reactivo Fundamento
Soluciónisotónica(NaCl 0.85%) Cuando las células se colocan en una solución
Isotónica,esdecirconunaconcentraciónsalina
similar a la de su medio, la concentración de
agua permanece constantedentroyfuerade la
célula por lo cual el volumen y su forma no se
alteran y pueden conservarse a largo tiempo.
Solución amortiguadora PBS 0.015 M, pH 7.2,
0.15 M NaCl)
El buffer de fosfatos se utiliza para mantener
las células en condiciones fisiológicas estables
durante periodos cortos manteniendo el pH y
la presión osmótica lo más parecido al
ambiente biológico natural.
Acetonafría Permite la recuperación de proteínas
eliminando componentes no proteicos,
polisacáridos,lípidos y compuestos fenólicos.
Soluciónde Acrilamida30%-Bisacrilamida
0.8%
La solución de Acrilamida se utiliza para verter
geles de poliacrilamida utilizados en la
secuenciación y electroforesis de proteínas.
Amortiguadordel gel separadorpH8.8 SufunciónesmantenerelpHdel gelseparador,
con un valor de 8.8.
Amortiguadordel gel separador pH6.8 Su funciónesmantenerel pHdel gel
separador,conun valorde 6.8.
Amortiguadorde corrida5X / SDS El tampónde ruptura o de carga se utilizapara
desnaturalizarlasproteínasde lamuestra para
mantenerlas desplegadas durante la
electroforesis.
Amortiguadorde muestrapH6.8 Mantener el pH estable de la muestra.
Persulfatode amonioal 10% p/v El persulfato de amonio forma los radicales
libres que inducen la polimerización de la
acrilamida y la bisacrilamida.
TEMED Se utiliza junto al persulfato de amonio para
catalizar la polimerización de acrilamida al
preparar geles para electroforesis.
Soluciónde azul de bromofenol 10mg/mL Se trata de un compuesto coloreado y con
carga, utilizadoparacomprobar el progresode
la electroforesis.
Soluciónteñidora Se utilizaparateñirel gel de poliacrilamida-SDS
y otras tinciones.
Solucióndestiñidora Se utilizaparadesteñirel gel de poliacrilamida-
SDS
Cuestionario previo

4. 1. Investigue que esunalectinade origenvegetal yal menos3características de las mismas.
Las lectinas son proteínas de origen no-inmunógeno que son capaces de interactuar de manera
específicayreversible conazúcaresde carbohidratoscomplejos,sinquelaestructuracovalentedel
ligando glicosídico en consideración sea afectada. (Kocurek,)
Se ha reportado que las lectinas de leguminosas por lo general se componen de dos o cuatro
subunidades,conunpesomolecularaproximadode 25-30kDaporsubunidad.Cadasubunidadtiene
un sitio de unión a carbohidratos (Sharon y Lis, 1990; Abhilash et al., 2013).
2. Investigue yfundamente 3aplicacionesde importanciade laslectinasde origenvegetalen
la industria farmacéutica
Las lectinas vegetales pueden tener diversas funciones: participan en las interacciones entre las
bacteriasfijadorasde nitrógenoconlaraízde plantasde leguminosas,poseenactividadmitogénica,
pueden tener efectos protectores en contra de la acción patogénica de ciertos microorganismos
como es el caso de los nemátodos herbívoros.
En diversas especies animales se han reportado evidencias de que las lectinas participan en
fenómenostalescomoel reconocimientoylaeliminaciónde glicoproteínasdelsistemacirculatorio,
así como de células envejecidas, células tumorales y microorganismos, mediante un proceso de
opsonización y la participación de células con actividad fagocítica. (Hernández y Martínez, 2005).
Se ha reportado también el uso de lectinas en casos de diabetes. En efecto,en casos de diabetes
insulina dependientes moderadas (menosde 30 unidades de insulina por día) una dieta adecuada
de leguminosas permitió eliminar el uso de la hormona. La adición de la lectina obtenida de
Phaseolusvulgaris ode concanavalina-Aaladietapodríasercapaz de producirefectossemejantes.
3. ¿En qué consiste lareacciónde hemoaglutinaciónentre unalectinade origenvegetal ylos
glóbulos rojos?
La aglutinación consiste en la agregación sistemática de células mediada por macromoléculas
especifica (anticuerpos o lectinas) que reconocen estructuras moleculares determinadas sobre la
superficie celular.
El ensayo de hemaglutinación es un método simple y sencillo para estimar en forma
semicuantitativa la presencia de actividad de lectina. Este método clásico permite detectar su
presenciaa travésde aglutinarglobulosrojoscomose observael siguiente figura(Ilustración1) La
cual los globulos rojos forman una malla que cubre todo el pocillo.

5. 4. Investigue
el fundamento
del SD-SPAGE así como de los reactivos utilizados.
Existen diferentes técnicas y aparatos para el uso de la separación y purificación de proteínas por
electroforesis. Sin embargo, la técnica más empleada es la formación de una placa de gel de
poliacrilamida en la que se utiliza el método desarrollado por Laemmli (1970). En este método se
llevaacabolapreparaciónde placasdegelde poliacrilamidaquecontienendodecil sulfatode sodio,
denominandoestatécnicacomoSDS‐PAGE.Lasplacasde gel de poliacrilamidase formanporlaco‐
polimerizaciónde laacrilamidaparalocual se utilizaunagenteentrecruzadorcomolaN,N’‐metilen
bis‐acrilamidaenpresenciade uncatalizadorde ionpersulfatoenformade persulfatode amonioy
uniniciadorcomoTEMED.La polimerizacióndependede latemperatura.Se recomiendautilizaruna
temperaturaporencimade los20°Cparaprevenirunapolimerizaciónincompleta.Lapolimerización
se debe realizarenuna atmósferainerte yaque el oxígenopuede actuarcomoun neutralizadorde
radicaleslibres,generadosporel iónpersulfato,porloque se debenutilizarcámarasverticalesque
dispongande dosplacasde vidriosselladasoentubosparaformargelesendisco(Discgel)yde esta
manera disminuir la absorción de oxígeno por los geles. La velocidad de polimerización está
determinadaporlaconcentraciónde persulfatode amonioyTEMED.Mientrasque laporosidad del
gel,ladeterminanlasproporcionesrelativasde poliacrilamida(C)ybis‐acrilamida(T),siendomenor
el poro cuanta más bisacrilamida haya en relación a la concentración de acrilamida. El porcentaje
total de acrilamida/bis‐acrilamida determina el rango de separación del gel. (
5. ¿Cuál esla utilidaddel SDS -PAGEenlaindustriafarmacéutica?
Se utilizaparala separaciónypurificaciónde proteínas
6. Existe algúnmétodode conservaciónparalaslectinas,¿cuál seríaypor qué?
Ilustración 1 Hemoaglutinación de globulos rojos con lectinas vegetales