Characterization of an acidic cold-adapted cutinase from Thielavia terrestris and its application in flavor ester synthesis

1. Actividad específica
Modulo: Obtención de metabolitos de interés industrial para la salud
Docente: M. en B. Patricia Martínez Cruz
Integrantes:
Córdova Martínez Ana Itzel
Cruz Arellano David Fernando
Esquivel Gonzales Ana Karina
Quiroz Matias Ana Lilia
Sánchez Juárez Samantha

2. Conceptos de actividad enzimática
Nikolaos, L. Protein Purification: An Overview. Methods in molecular biology. Vol.1129 (2014) pp. 3-9
Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1µmol de sustrato en producto en 1 minuto de
reacción, bajo condicionespreviamente determinadas.
Actividad enzimática o concentración de enzima:
unidades de enzima por ml de solución (U/ml)
Actividad específica (U/mg): actividad enzimática
(U/ml)/concentración de proteínas (mg/ml) de la solución.

4. Purificación de enzimas
◉ Es un proceso que consta de varias etapas cuyo objetivo es
lograr la concentración diferencial de la enzima de interés.
 Los pasos para la separación pueden explotar las diferencias en
las propiedades químicas, estructurales o funcionales entre la
enzima de interés y otras proteínas presentes en la mezcla cruda.
Nikolaos, L. Protein Purification: An Overview. Methods in molecular biology. Vol.1129 (2014) pp. 3-9
Se trata de eliminar
contaminantes
Además, eliminar la presencia
de isoformas de origen
postraduccionales

5. Estas propiedades incluyen: tamaño, forma, carga, punto isoeléctrico,
distribución de carga, hidrofobicidad, solubilidad, densidad, afinidad de
unión al ligando, unión al metal, asociación reversible, modificaciones
postraduccionales y secuencias o estructuras específicas.
Las variaciones en las propiedades físicas y químicas de las proteínas/enzimas,
generalmente se pueden aprovechar en pasos diferentes de fraccionamiento y
cromatografía para diseñar un esquema de purificación viable.
Nikolaos, L. Protein Purification: An Overview. Methods in molecular biology. Vol.1129 (2014) pp. 3-9

6. Primer paso para la purificación de
proteínas/enzimas
Preparación de un extracto crudo obtenido por lisis celular.
El extracto contendrá una mezcla compleja de todas las
proteínas del citoplasma y macromoléculas, cofactores y
nutrientes adicionales.
Los desechos se eliminan por centrifugación y el sobrenadante
se recupera. El extracto crudo se puede usar para algunas
aplicaciones en biotecnología, sin embargo, si la pureza es
requerida, se deben seguir los pasos de purificación
posteriores.
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7. Segundo paso en la purificación de enzimas
◉ A partir del extracto crudo, por precipitación en una solución salina, generalmente se
realiza usando sulfato de amonio como la sal.
◉ Diferentes proteínas precipitarán en diferentes concentraciones de sulfato de amonio.
Las proteínas de mayor peso molecular se precipitan en concentraciones más bajas de
sulfato de amonio.
◉ La precipitación de sal no suele conducir a una proteína altamente purificada, pero puede
ayudar a eliminar algunas proteínas no deseadas en una mezcla. Las sales en la
solución se eliminan por diálisis a través de un tubo de celulosa porosa, filtración o
cromatografía de exclusión en gel.
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8. Tercer paso purificación final
◉ Para aplicaciones que requieren la mayor pureza pero
cantidades relativamente pequeñas de enzima, se puede
elegir cromatografía para purificar selectivamente la
enzima de interés.
◉ La cromatografía de afinidad es la técnica de purificación
de proteínas más específica y efectiva, proporcionando
una base racional para la purificación de enzimas de
interés.
◉ Explota la capacidad de las macromoléculas
biológicamente activas para formar complejos específicos
y reversibles con ligandos de afinidad, este enfoque se
desplaza hacia el diseño y la selección de ligandos de alta
afinidad y especificidad.
Nikolaos, L. Protein Purification: An Overview. Methods in molecular biology. Vol.1129 (2014) pp. 3-9

9. Ensayo enzimático
1. Se añadieron 50 μl de enzima diluida a 400 μl de tampón de
citrato sódico 50 mM (pH 4.0) y precalentado por 2 minutos.
2. Se le agregaron 50 μl de pNPB (p-butirato de nitrofenilo) 20
mM preparados en isopropanol puro.
3. La mezcla de reacción se incubó a 50ºC durante 10 minutos.
4. 500 μl de tampón de fosfato de sodio 300 mM (pH 7.0) que
contenía 5% de SDS (p/v) se añadió para terminar la reacción.
5. Después de que la mezcla se enfrió en hielo durante 2
minutos, libera el pNP (p-nitrofenol). Se cuantificó midiendo la
absorbancia a 410 nm.
 Uno unidad de enzimática se definió como la cantidad de
enzima que libera 1 μmol pNP por minuto bajo las condiciones
anteriores.
 la concentración de proteínas
se estimó de acuerdo con el
método de Lowry.
 Actividad específica fue
expresado en términos de
unidades de enzimas por
miligramo de proteína.
Cutinasa

10. Tabla 1 del artículo: Characterization of an acidic cold-adapted cutinase from Thielavia terrestris
and its application in flavor ester synthesis
Actividad total (Total activity): Actividad
enzimática x volumen total
Proteínas totales (Total protein): [] de
proteínas x volumen total.
Actividad específica (Specific activity):
actividad enzimática/ [] de proteínas
Purificación total (Purification Factor):
Actividad específica etapa/ Actividad
específica primera etapa.
Rendimiento total (Yield): (Actividad total
etapa/Actividad total primera etapa) x 100.
Protein purification. Disponible en (https://www.scienceforums.net/topic/10426-protein-purification-help/)

11. Ejemplo
Un investigador estaba tratando de purificar la acetilcolinesterasa de cerebro de rata por medio de diversas
técnicas. Él reportó sus datos en la siguiente tabla pero omitió calcular algunos valores útiles.
Paso de purificación
Actividad total
(µmol/min)
Proteína total
(mg)
Actividad específica
(µmol/min*mg)
Factor de
purificación
%
Rendimiento
Homogenizado de tejido fresco. 55670.00 333.40
166.98 1.00 100.00
Precipitación con (NH4)2SO4 55670.00 124.00 448.95 2.69 100.00
DEAE-celulosa 28950.00 115.00 251.74 1.51 52.00
concentración y díalisis 27840.00 107.00 260.19 1.56 50.01
sephadex-G200 23380.00 56.00 417.50 2.50 42.00
Cellex-P (intercambio catiónico) 13920.00 55.40
251.26 1.50 25.00
DEAE-celulosa 8910.00 11.30 788.50 4.72 16.01
DEAE-sephadex 6680.00 11.10 601.80 3.60 12.00
cromatografía de afinidad 4680.00 4.80 975.00 5.84 8.41
Purificación total: Actividad específica etapa/ Actividad específica primera
etapa.
Rendimiento total (%): (Actividad total etapa/Actividad total primera etapa) x
100.
Actividad total: Actividad enzimática x volumen total
Proteínas totales: [] de proteínas x volumen total.
Actividad específica: actividad enzimática/ [] de proteínas

12. Ejemplo
Un investigador estaba tratando de purificar la acetilcolinesterasa de cerebro de rata por medio de
diversas técnicas. Él reportó sus datos en la siguiente tabla pero omitió calcular algunos valores útiles.
Paso de purificación
Actividad total
(µmol/min)
Proteína total
(mg)
Actividad específica
(µmol/min*mg)
Factor de
purificació
n
%
Rendimiento
Homogenizado de tejido fresco. 55670.00 333.40 166.98 1.00 100.00
Precipitación con (NH4)2SO4 55670.00 124.00 448.95 2.69 100.00
DEAE-celulosa 28950.00 115.00 251.74 1.51 52.00
concentración y díalisis 27840.00 107.00 260.19 1.56 50.01
sephadex-G200 23380.00 56.00 417.50 2.50 42.00
Cellex-P (intercambio catiónico) 13920.00 55.40 251.26 1.50 25.00
DEAE-celulosa 8910.00 11.30 788.50 4.72 16.01
DEAE-sephadex 6680.00 11.10 601.80 3.60 12.00
cromatografía de afinidad 4680.00 4.80 975.00 5.84 8.41
Actividad total: Actividad enzimática x volumen total
Proteínas totales: [] de proteínas x volumen total.
Actividad específica: actividad enzimática/ [] de proteínas
Purificación total: Actividad específica etapa/ Actividad específica primera
etapa.
Rendimiento total (%): (Actividad total etapa/Actividad total primera etapa) x
100.