La práctica describe los pasos para extraer y aislar ADN de plantas. Primero, se rompe la pared celular y las membranas con un tampón de extracción para liberar el contenido celular y nuclear donde se encuentra el ADN. Luego, se añade zumo de piña o papaya para eliminar proteínas y separar el ADN. Finalmente, se precipita el ADN añadiendo alcohol, ya que es soluble en agua pero no en alcohol. El objetivo es visualizar las fibras de ADN.

1. Materia Biología
Dra. Ana María Ortuño Tomás
Dpto. Biología Vegetal (
p g g (Fisiología Vegetal)
g g )
í
Facultad de Biología
Universidad de Murcia

3. Objetivo: Visualizar los fenómenos osmóticos de turgencia y
plamolisis celular.
Introducción:
La célula vegetal adulta encierra una voluminosa vacuola
separada del medio que la rodea por una membrana llamada
tonoplasto.
tonoplasto Esta se comporta en primera aproximación como
membrana semipermeable con respecto a numerosas
sustancias disueltas, como por ejemplo el cloruro sódico o la
sacarosa.
sacarosa
La pared celular rígida, limita la posibilidad de dilatación de la
célula y en consecuencia la absorción de agua Ello constituye
agua.
por otra parte, un marco gracias al cual, los cambios de agua
son perceptibles directamente.

4. Material:
Hojas de cebolla.
Colorante rojo neutro al 1 % en tampón fosfato 0,1 M
pH=7,4.
pH=7 4
Disolución de NaCI al 6 %.
Microscopio óptico.

5. Manipulación:
Sirviéndose de pinzas y bisturí, tomar un fragmento de
epidermis, de la parte interna del casco de cebolla, de
aproximadamente 0,5 cm de lado.
Sumergirlo durante un minuto en la disolución de rojo neutro
al 1 % solubilizado en tampón fosfato 0,1 M pH=7,4.
pH 7,4.
Montar el fragmento de epidermis en el porta, tapándolo a
continuación con el cubre, eliminando el exceso de liquido
succionando con papel de filtro y observar al microscopio.

6. Manipulación:
Reemplazar el colorante, en la preparación, con disolución de
NaCl al 6%, colocando unas gotas de esta disolución en el
p
porta-objetos, junto a un borde del cubre, pero sin
j j p
mancharlo y colocando un fragmento de papel de filtro en el
lado opuesto, para aspirar por capilaridad el colorante.
La disolución de l
L di l ió d cloruro sódico ocupará el l
ódi á l lugar d aquel, l
de l lo
que se reconoce porque el líquido de la preparación se aclara.
Repetir los lavados cuatro o cinco veces y observar
inmediatamente la preparación al microscopio
microscopio.

7. Información que debe adquirir o cuestiones que debe resolver
el alumno con el desarrollo de la práctica:
¿A qué se d b l gran extensión d l coloración d l célula
A é debe la ió de la l ió de la él l
tras la tinción con rojo neutro?
¿Qué papel d
Q é l desempeñan l dif
ñ las diferentes concentraciones d l
t t i de las
disoluciones de tampón fosfato y de cloruro sódico sobre la
del jugo vacuolar?
¿A qué atribuye los cambios que se observa en la vacuola en
cada caso?

9. Objetivo: Observar granos de almidón de la patata y conocer la
j g p
técnica de tinción con Lugol para el reconocimiento de la
presencia de dicho polisacárido.
Introducción:
El Lugol es una disolución acuosa de yodo y yoduro potásico
que sirve para averiguar si, en una disolución de azúcares no
reductores (reacción de Fehling negativa)
negativa), existe el
polisacárido almidón (prueba de lugol positiva).
El almidón es un polisacárido mezcla de amilosa y amilopectina
amilopectina.

10. Cuando el almidón se pone en contacto con unas gotas de
p g
Lugol toma un color azul-violeta característico (la amilosa se
colorea de azul oscuro a negro y la amilopectina se colorea
entre naranja y amarillo).
Se trata de una reacción no química, en la que se forma un
compuesto de inclusión del yodo en el interior de las hélices
de la amilosa Esta inclusión es reversible y está condicionada
amilosa.
por la temperatura.

11. Material:
Patata
Microscopio óptico
Reactivo Lugol (yodo-yoduro potásico 1%)
(yodo yoduro
Suspensión acuosa de almidón
Manipulación:
Coger un trozo de patata, añadirle una gota de agua en la
superficie y hacer un raspado de tejido.
Se obtiene una suspensión de granos de almidón que
enturbia la gota de agua, dándole color blanquecino.
Poner una gota de esta suspensión sobre el porta, colocar
el cubre y observar al microscopio.

12. Manipulación:
p
Poner ahora una gota de reactivo yodo-yoduro potásico
(1%) sobre el porta, en contacto con el borde del cubre, y
con un papel de filtro en el borde opuesto, hacer que
penetre en l preparación.
t la ió
Observar de nuevo en el microscopio.
+ Lugol

13. Manipulación:
p
En caso de que no se disponga de microscopio:
Se puede hacer reaccionar la suspensión obtenida tras el
raspado de la patata con una gota de reactivo yodo-yoduro
p p g y y
potásico (1%), para observar el cambio de coloración.
Se coloca en un tubo de ensayo 3 ml de una suspensión
acuosa d almidón, se l añaden 3 gotas d l solución d
de l idó le ñ d de la l ió de
Lugol, se observará la aparición del color azul-violeta
característico.
A continuación se calienta suavemente, sin que llegue a
hervir, se observará que pierde el color, posteriormente se
enfría el tubo de ensayo con agua del grifo y después de
unos 2-3 min reaparecerá el color azul.

14. Información que debe adquirir o cuestiones que debe resolver
q q q
el alumno con el desarrollo de la práctica:
Conocer la forma de los grados de almidón obtenidos a partir
g p
de este material vegetal.
Relacionar el tamaño de los granos y el número de capas que
se observan en ellos.
b ll
Conocer la posibilidad de utilizar el reactivo yodo-yoduro
potásico (1%) para d t t
tá i detectar l presencia d almidón en un
la i de l idó
medio.
Fundamento de la reacción de color y de los cambios con la
temperatura.

16. Objetivo: Poner de manifiesto la presencia de azúcares
j p
reductores en un medio, mediante una reacción d color d
d di di ió de l de
tipo redox.
Introducción:
Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen
poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en
su molécula.
El reactivo de Fehling es utilizado con el fin de poner de
manifiesto la capacidad reductora de un azúcar. Consiste en
una mezcla de dos reactivos: el Fehling A (sulfato cúprico),de
g ( p ),
color azul, y el Fehling B (tartrato sódico-potásico), incoloro.
Tras la reacción con el glúcido reductor, se forma óxido de
Cobre (I) que tras ser calentado da un precipitado de color
(I),
rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha
producido una reacción de tipo redox y que por tanto, el
glúcido presente es reductor.

17. Material y Manipulación:
p
1ª parte
Poner en tubos de ensayo 3 ml de solución acuosa de
g
glucosa, fructosa, sacarosa y almidón.
, ,
Añadir en cada tubo 1 ml de solución de Fehling A (contiene
CuSO4) y 1 ml de Fehling B (tartrato sódico-potásico, para
alcalinizar el medio y permitir l reacción).
l li i l di i i la ió )
Calentar los tubos en un baño maría hasta que hiervan
durante 10 minutos.
d t i t
La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo
y será negativa si queda azul o cambia a un tono azul azul-
verdoso.

18. Material y Manipulación:
2ª parte
La sacarosa es un disacárido que carece de poder reductor (porque en el enlace
de los monosacáridos que forman parte de su molécula participan los
carbonos anoméricos), por lo que la reacción con el reactivo de Fehling es
), p q g
negativa, tal y como ha quedado demostrado en la 1ª parte.
Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza y se
desco po e e os o osacá dos
descompone en los monosacáridos que la forman, glucosa y fructosa, que sí
a o a , g ucosa uctosa, s
son reductores.
La prueba de que se ha verificado la hidrólisis se realiza con el reactivo de
Fehling y, si el resultado es positivo, aparecerá un precipitado rojo (tras el
calentamiento en baño maría a ebullición durante 10 min).
Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se habrá realizado correctamente, y
si en el resultado final aparece una coloración verde en el tubo de ensayo se
debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa.

19. Material y Manipulación:
2ª parte
Para llevar a cabo esta parte de la práctica:
Tomar 3 ml de solución de sacarosa y añadir 10 gotas de HCl diluido.
Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos.
Dejar enfriar.
Neutralizar añadiendo 3 ml de solución alcalina
alcalina.
Realizar la prueba de Fehling como se indica en la 1ª parte.

20. Información que d b adquirir o cuestiones que d b resolver
f ó debe d debe l
el alumno con el desarrollo de la práctica:
Establecer a qué se deben las diferencias observadas entre
los cuatro carbohidratos analizados (glucosa y fructosa dan
positiva la reacción de Fehling mientras que sacarosa y
Fehling,
almidón no dan positiva la reacción).
Analizar e interpretar los resultados obtenidos tras la
hidrólisis de la sacarosa.

22. Objetivos: Romper o lisar con detergentes la pared celular, la
membrana plasmática y la membrana nuclear para dejar libre
el ADN y hacer que precipite en alcohol, para poder visualizar
las fibras del ADN
ADN.

23. ¿QUÉ ES EL ADN?ES EL ADN
Práctica 4: Extracción y
ADN es la abreviatura del Acido
DesoxirriboNucleico. Es la molécula de la vida
pues constituye el material genético de todos
aislamiento de ADN los organismos vivos y se encuentra en el
interior del núcleo de las células El ADN es el
células.
componente químico primario de los cromosomas
y el material que constituye los genes.
..
Su función esencial es la de conservar la
información durante la división celular,
transmitirla de generación en generación y
hacer efectiva la información genética que
contiene.
Cedido amablemente
por la Dra. Leonor Ruiz ETAPAS Y FUNDAMENTO DE LA EXTRACCIÓN DE ADN DE PLANTAS
TAPAS ¿QUÉ HACEMOS? ¿POR QUÉ LO HACEMOS? ¿CÓMO LO HACEMOS?
ªEtapa Rompemos la pared celular y Para liberar el contenido celular y Mezclando el material
las membranas plasmática y nuclear,
nuclear en el que se encuentra el vegetal con una solución de
nuclear ADN extracción y trituramos
ªEtapa Separamos el ADN de Las proteínas y restos celulares Añadiendo al tampón de
proteínas y restos celulares interfieren en la extracción de extracción zumo de piña o de
ADN papaya que contienen un
enzima, la papaína, que
elimina las proteínas
ªEtapa Precipitamos el ADN La molécula de ADN es soluble en Añadimos alcohol sobre la
agua pero no en alcohol, por lo que fase acuosa que contiene el
precipitará en la interfase entre ADN disuelto
ambos
APLICACIONES
Agricultura y ganadería:
Nos ayuda a conocer el genoma de los seres
vivos para saber más de ellos Gracias al estudio
ellos.
del ADN podemos distinguir entre especies y
variedades, encontrar características de
interés agronómico (producción, sabor, color,
resistencias a enfermedades,…). Obtener
nuevas variedades mejoradas.

24. Protocolo de Extracción de ADN
Equipos Productos
• Tubos plástico
• Guisantes
• Vasos de plástico
• Agua destilada
• Colador
• Detergente lavavajillas
• Cucharilla de café
• Sal
• Una batidora
• Zumo de piña o de papaya
• Hielo
• Alcohol de 96º muy frío
• Gasa para colar
AHORA VIENE LA PARTE DIVERTIDA;
Cedido amablemente
1 Tu fuente de ADN va a ser 30gr de guisantes
por la Dra. Leonor Ruiz
2. Tampón de extracción: En un vaso echamos media cucharadita de detergente de
lavavajillas, una pizca de sal y media cucharadita de zumo de piña. Añadimos 30 ml de
agua destilada.
3.- Mezclamos esta solución con los guisantes
4.- Trituramos la mezcla, con la batidora, a velocidad máxima durante 30
segundos
5.- Filtramos el líquido obtenido con un colador y gasa.
6.- Llenamos la mitad de un tubo con la disolución filtrada.
7.- Añadimos cuidadosamente la misma cantidad de alcohol muy frío, haciéndolo
resbalar por las paredes del tubo para que f
b l l d d lt b forme una capa sobre el filtrado.
b l filt d
8.- Dejamos reposar durante 2 ó 3 minutos
9.- Podemos ver una madeja algodonosa ¡Enhorabuena estáis viendo el ADN!

25. Información que debe adquirir o cuestiones que debe resolver
el alumno con el desarrollo de la práctica:
¿Para qué se utiliza el detergente y el NaCl en la extracción?
¿Qué componente aporta el zumo de piña o de papaya y cuál
es su utilidad?
tilid d?
¿Por qué se incorpora finalmente el etanol muy frío al medio?

27. Objetivo: Estudiar la producción de CO2 durante la respiración e
j p p
investigar el efecto de un inhibidor de la glicolisis.
Introducción:
La respiración es un proceso por el cual las células obtienen
energía, mediante la degradación de compuestos orgánicos
tales como los azúcares, de alto contenido energético.
La glicolisis consiste en la conversión de un azúcar sencillo
(hexosa) en dos moléculas de piruvato.
Esta ruta prácticamente común a todos los seres vivos, consta
de varios pasos catalizados enzimáticamente.

28. Introducción:
Uno de ellos, el paso de 2-Fosfoglicerato a Fosfoenolpiruvato,
está catalizado por el enzima Enolasa, que necesita la
p , q
presencia de iones Mg2+ para poder actuar.
En presencia de iones F- , el Mg2+ se compleja en forma de
MgF
M F2, con l cual se i hib l glicolisis y no h respiración.
lo l inhibe la li li i hay i ió
En el transcurso de la glicolisis se producen, por cada molécula
de l
d glucosa, 2 moléculas d ATP y otras d
lé l de ATP, t dos d coenzimas
de i
reducidos (NADH + H +).

29. Introducción:
El piruvato puede sufrir distintas transformaciones
dependiendo del tipo de organismo y de las condiciones en
p p g
que se encuentre.
En presencia de O2, los seres aerobios y facultativos continúan
la
l oxidación d l piruvato, a través d l ciclo d K b y d l
id ió del i é del i l de Krebs de la
cadena de transporte de electrones de las mitocondrias, hasta
dar CO2 y H2O como productos finales.
Los organismos anaerobios, y los facultativos en ausencia de
O2, transforman el piruvato en otros compuestos más
reducidos, para regenerar el NAD+ necesario para continuar
g
la l l
l glicolisis, con l cual l mayor parte d l energía d l
lo l la de la í de la
glucosa es desaprovechada.

30. Introducción:
Esta vía se conoce con el nombre de fermentación, y
dependiendo del producto final se le llama alcohólica, láctica,
p p , ,
etc.…
En el caso que vamos a estudiar, las levaduras Saccharomyces
cerevisiae son organismos f
i i i facultativos, que en ausencia d O2
l i i de
producen CO2 y etanol a partir del piruvato, por lo cual son
muy utilizados industrialmente, por ejemplo en la fabricación
de la cerveza
cerveza.

31. Material:
Levaduras en suspensión acuosa durante 24 h a 25ºC.
Disolución de glucosa al 5%.
g
Disolución de NaF 0,01, 0,05 y 0,10 M
Tubos de ensayo para respirómetro

32. Manipulación:
Antes de empezar a operar, rotule 5 tubos graduados,
numerándolos del 1 al 5 en la parte cerrada del tubo.
Para construir el respirómetro simple, llene con suspensión
de levaduras, agua, solución de glucosa e inhibidor según se
indica a continuación en la Tabla
Tabla.
Coloque un tubo de ensayo grande (de mayor diámetro que el
graduado) sobre el graduado introduciéndolo lo más posible
posible,
y presionando ambos, invierta el conjunto rápidamente, de
manera que derrame la menor cantidad de líquido posible.

33. Manipulación:
Se mide el volumen de aire que queda entre el líquido y el
fondo del tubo graduado e invertido, y se anota.
Si las levaduras respiran, el CO2 desprendido se acumulará en
la cámara de aire, aumentando la presión sobre el líquido,
con lo que éste será desplazado y el volumen gaseoso
aumentará.
Al cabo de una hora aproximadamente midiendo el volumen
aproximadamente,
final de la cámara gaseosa y restándolo del inicialmente
obtenido, tendremos una medida de la cantidad de
respiración que haya tenido lugar.
p q y g

34. Nº
Tubo
Suspensión
de
Agua
destilada
Solución
de glucosa
NaF Volumen
inicial
Volumen
final
Diferencia de
volúmenes
levadura 10% cámara cámara (indicativo del CO2
gaseosa gaseosa desprendido)
1 5 ml 10 ml
2 5 ml 5 ml 5 ml
3 5 ml 5 ml 5 ml (0,01M)
4 5 ml 5 ml 5 ml (0,05M)
5 5 ml 5 ml 5 ml (0,1M)

35. Información que debe adquirir o cuestiones que debe resolver
el alumno con el desarrollo de la práctica:
Razonamiento sobre los procesos que están ocurriendo en
cada uno de los 5 tubos.
¿Cuál es la función del tubo 1?
¿Por qué se añade glucosa a los tubos 2, 3, 4 y 5?
Diferencias observadas en los tubos 3, 4 y 5 (inhibición
parcial o total dependiendo de la concentración del
inhibidor).
inhibidor)