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- 1. PRÁCTICA 7
- 2. ROL DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO - ETIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES DEL SISTEMA DIGESTIVO 14/06/2020
- 3. 14/06/2020
- 4. 14/06/2020
- 5. FASE PRE ANALÍTICA • INDICACIONES • TOMA DE MUESTRA • TRANSPORTE 14/06/2020
- 6. LA MUESTRA Heces Antes de la administración de cualquier antibiótico No más de dos horas Muestras en pañales o en papel higiénico no son adecuadas * Envase de boca ancha con tapa 14/06/2020
- 7. LA MUESTRA Hisopado rectal - Uso de medio de transporte: – CaryBlair, Medios Stuart, o de transporte universal (NO REFRIGERAR) Si la muestra no se cultiva de inmediato, antes de las 2 horas, se recomienda colocarla en un medio de transpporte: Cary Blair
- 8. FASE ANALÍTICA • EXAMEN DIRECTO – Microscopía: Reacción inflamatoria: Shigela ( Neutrófilos PMN) – Pruebas directas: Rotavirus, Adenovirus – Coloraciones: Campylobacter • CULTIVO – Aislamiento primario – Aislamiento por enriquecimiento • FACTORES DE PATOGENICIDAD – Método inmunológico: ELISA – Método genético: sondas ADN / PCR 14/06/2020
- 9. EXAMEN MACROSCOPICO • COLOR: :Marrón, amarilla, verdosa, blanca, negra, roja etc. • ASPECTO : Sanguinolenta, agua de arroz etc. • CONSISTENCIA: Pastosa, liquida, semi- solida, solida ( restos alimentarios) • MOCO • SANGRE : Presencia o ausencia : Presencia o Ausencia 14/06/2020
- 10. DETERMINACION DE SANGRE OCULTA (EDA INVASIVOS) La membrana del test está sensibilizada con anticuerpos anti hemoglobina humana en la zona del test. Complejo antígeno- anticuerpoconjugado, que migra a través de la membrana cromatográficamente por capilaridad
- 11. EXAMEN MICROSCOPICO Examen con Azul de metileno : LEUCOCITOS 14/06/2020
- 12. COLORACION VAGO - GERMENES ESPIROQUETAS, QUE NO SE COLOREAN CON EL METODO DE GRAM NI POR EK DE ZIEHL NEELSEN. - FIJAR LA MUESTRA CON OH 95% - COLOREAR CON EOSINA AL 2% 4 MINUTOS - LAVAR CON AGUA DE CAÑO - COLOREAR CON CRISTAL VIOLETA 2 MINUTO. 14/06/2020
- 13. SIEMBRA PRIMARIA EN MEDIOS DE CULTIVO 14/06/2020
- 14. MEDIO DE CULTIVO: Agar Mac Conkey MEDIO DE CULTIVO: Agar SS AGAR Cefsulodin – Irgasan Novobiocina (Agar CIN) AGAR: TCBS • Contiene azul de bromotimol y azul de timol como indicador de pH El tiosulfato y citrato a las enterobacterias y da alcalinidad al medio. • Bilis suprime a los enterococos. • V. Cholerae fermenta la sucrosa y V. paraemolyticus no fermenta la sucrosa Aislamiento selectivo de Yersinia enterocolitica. La selectividad de este medio se basa en la presencia de violeta cristal, Irgasan y sales biliares (- Gram(+) y cefsulodin y novobiocina ( - bacterias Gram (-)) BD TCBS Agar (agar tiosulfato citrato bilis sacarosa) es un medio selectivo de diferenciación para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae.
- 15. AGAR MAC CONKEY Separa las bacterias fermentadoras de lactosa de aquellas que no la fermentan. Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben a bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas. Las bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias que varían en el tono rojo dependiendo del ácido producido. Las no fermentadoras de lactosa producen colonias incoloras.
- 17. AGAR SALMONELLA-SHIGELLA Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa forman colonias translúcidas o incoloras. Este medio contiene sales de hierro para la detección de sulfuro de hidrógeno, las bacterias productoras forman colonias con un centro negro debido a la precipitación de sulfuro férrico.
- 18. AGAR MAC CONKEY con SORBITOL: Medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de Escherichia coli O157 H7. CALDO SELENITO: Es un medio de enriquecimiento identifica Salmonella. Sospecha de Shigella, Salmonella. E. Coli, Vibrio Incuba 37 ºC x 18-24 horas. CALDO PEPTONADO ( FUENTE DE NITROGENO) V. Cholerae y otros vibrios Incubar 37 ºC x 6-8 horas 14/06/2020 PRE - ENRIQUECIMIENTO
- 19. Medios para Cultivo de Campylobacter Cualquier medio Agar Base rico en aminoácidos Suplemento con agar sangre (ovina, equina) al 5% Una mezcla de antibióticos para inhibir flora acompañante 14/06/2020
- 20. Campylobacter es un bacilo, microaerofílico, Gram negativo, muy móvil, de cultivo lento y con una temperatura óptima de crecimiento de alrededor de 37-42ºC. Estas características dificultan su aislamiento y por ello se le considera un agente de “cultivo fastidioso. Medios para Cultivo de Campylobacter
- 22. membrana de Método de Filtración Celulosa con cobre Agar sangre para la detección de Campylobacter en Heces Colonias puntiformes, gotas de agua 14/06/2020
- 23. 14/06/2020 Diagnóstico Microbiológico Convencional Inmunológico Se busca la recuperación de agente patógeno Los cultivos requieren tiempo prolongado de proceso para lograr un diagnostico. Se busca la evidenciar la presencia del agente patógeno Las pruebas Inmunológicas permiten acortar el tiempo de espera para el diagnóstico.
- 24. PRUEBAS RAPIDAS Inmunocromatografía para Enteropatógenos VIRUS: Rotavirus, Adenovirus BACTERIAS: Campylobacter, E. coli O 157 TOXINA: Clostridium difficile PARASITOS: Cryptosporidium, Giardia 14/06/2020
- 25. TOXINA: Clostridium difficile Campylobacter Elisa para Campylobacter 14/06/2020
- 26. Prueba de látex para Hepatitis A Elisa para Helicobacter pylori Elisa para Hepatitis A 14/06/2020
- 27. Diagnóstico etiológico presuntivo y confirmativo Helicobacter pylori Demostración de la producción de amonio por ureasa mediante test rápido Endoscopia digestiva alta 14/06/2020 El H pylori está presente, las bacterias convierten la urea en dióxido de carbono, el cual se detecta y se registra en su respiración exhalada después de 10 minutos. Este examen puede identificar a casi todas las personas que tienen H pylori.
- 30. 14/06/2020
- 35. Resultados - Tinción Gram Gram Negativo Gram Positivo
- 36. AGAR SANGRE ( Hemolisis) Estas enzimas producen cambios visibles en las placas de agar sangre: – Hemólisis alfa: Zona de hemólisis incompleta de los eritrocitos con formación de un halo verdoso alrededor de la colonia. – Hemólisis beta: Zona de hemólisis completa de los eritrocitos y reducción de la hemoglobina con formación de un halo transparente o claro alrededor de la colonia. – Ausencia de hemólisis o hemólisis gamma: Ausencia de daño de los eritrocitos
- 38. AGAR MUELLER HINTON En este medio la infusión de carne y la peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas, carbón y aminoácidos. El medio contiene almidón para absorber metabolitos tóxicos Este agar realizar las pruebas de susceptibilidad bacteriana a los antibióticos debido a su alta reproducibilidad..
Notas del editor
- El aparato digestivo es la región más colonizada del organismo. El número y tipo de microorganismos presentes, varía de acuerdo con las diferentes localizaciones y la función de cada tramo digestivo.
- la diarrea implica un aumento de la frecuencia y una disminución en la consistencia de las deposiciones. En niños menores de 2 años, la OMS define la diarrea como la producción de tres o más deposiciones líquidas o semilíquidas en 12 horas, o de al menos una con sangre, mucus o pus. Tiene habitualmente un origen infeccioso: bacteriano, viral o parasitario. Involucra muchas veces alteraciones funcionales o inflamatorias a nivel intestinal, con frecuente repercusión gástrica, configurando una gastroenteritis. Estas afecciones tienen habitualmente un origen exógeno, con excepción de algunas formas de diarrea postantibióticoterapia. a enfermedad diarreica aguda (EDA), continúa siendo a nivel mundial, y principalmente en los países del tercer mundo, un importante problema de salud pública con una elevada tasa de morbi-mortalidad infantil. En nuestro país la enfermedad diarreica aguda está sufriendo una transición epidemiológica a favor de episodios de EDA sin deshidratación, Diversos microorganismos como protozoarios, virus y bacterias pueden ser responsables de cuadros intestinales caracterizados por diarrea, acompañada en ocasiones de vómitos, dolor abdominal y fiebre. Este cuadro suele ser de cortas duración y autolimitado. Ante la sospecha de una gastroenteritis bacteriana es necesario realizar un cultivo de heces o “coprocultivo” para aislar e identificar el microorganismo responsable del proceso diarreico. En las infecciones intestinales los patógenos ingresan y colonizan una porción del intestino. Excepto en aquellos casos en los cuales se ingiere una toxina preformada, la
- as bacterias enteropatógenas producen diarrea por diversos mecanismos: - Diarrea mediada por enterotoxinas, sin daño de la mucosa intestinal ni respuesta inflamatoria. En el examen microscópico de las heces no se observan ni leucocitos ni eritrocitos. Las bacterias responsables de este tipo de enfermedad diarreica son: Escherichia coli enterotoxigénica, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacilus cereus. - Diarrea mediada por invasión de la mucosa intestinal y presencia de respuesta inflamatoria. Este tipo de diarrea se manifiesta con presencia de leucocitos fecales, fiebre y leucocitosis sanguínea. Debido a que la invasión bacteriana se limita a las capas superficiales de la mucosa intestinal, los pacientes usualmente no presentan bacteriemia. Las bacterias más comúnmente responsables de este cuadro infeccioso son: Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp. Y Escherichia coli enteroinvasiva. - Diarrea mediada por invasión de la pared intestinal y diseminación bacteriana linfática. A menudo, la diarrea no es el síntoma principal (e incluso el paciente puede presentar constipación al inicio de la enfermedad). El examen de las heces revela a menudo leucocitos y eritrocitos. Salmonella typhi y Yersinia enterocolitica son las bacterias involucradas con más frecuencia, siendo capaces además de producir bacteriemia y linfadenitis mesentérica.
- El tubo digestivo contiene abundante microbiota intestinal (Microbiota entérica normal), la misma que en condiciones fisiológicas normales desempeña funciones benéficas para el hombre. La microbiota cólica del adulto se caracteriza por una gran densidad y diversidad bacteriana: Un gramo de heces contiene entre 109 y 1010 bacterias pertenecientes a más de 400 especies diferentes, principalmente anaerobias estrictas (Bacteroides, Clostridium, Peptostreptococcus, Peptococcus, etc.).
- TOMA DE MUESTRA Las heces se deben recoger en un frasco estéril de boca ancha y tapón a rosca. Si el transporte y cultivo bacteriano se van a demorar más de 4 horas, las muestras deben enviarse en medio de transporte de Cary-Blair, excepto en el caso de sospecha de diarrea por Clostridium difficile, en el que se deben enviar en un frasco limpio y seco. o La defecación se efectúa en un recipiente limpio, libre de residuos de detergentes o desinfectantes, siendo además muy importante que las heces no se mezclen con la orina. o Una pequeña cantidad de heces es entonces recogida con una espátula y trasladadas a un recipiente estéril con boca ancha y cierre hermético. Deben preferirse para su recolección las partes que contienen moco y sangre. o La muestra deberá ser enviada inmediatamente al laboratorio y procesada lo más rápidamente posible o, en caso contrario, conservada como máximo una noche a + 4°C a fin de evitar la desecación y la proliferación de bacterias y levaduras comensales.
- o La toma de muestra mediante hisopado rectal puede ser útil, principalmente en recién nacidos. El hisopo deberá introducirse en un medio de transporte adecuado (Cary-Blair). Conservación y transporte de la muestra: Si la muestra no se cultiva de inmediato, antes de las 2 horas, se recomienda colocarla en un medio de transpporte: Cary Blair y mantenerla a temperatura ambiente por un lapso no mayor a 5 días..
- • Describir y desarrollar la técnica del coprocultivo con el objetivo de aislar, a partir de una microbiota compleja, las especies consideradas como enteropatógenas. Examen directo - Examen macroscópico: consistencia, color, olor, presencia o ausencia de moco y/o sangre. - Examen microscópico: para determinar rápidamente la naturaleza de una enfermedad diarreica ese investiga los leucocitos fecales, que consiste en determinar el tipo de células inflamatorias presentes en las heces; esta información orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso, ejemplo, en la shigelosis hay abundancia de neutrófilos polimorfonucleares. Campylobacter sp.: A partir del medio PM, después del período de incubación durante 48 horas a 42 °C en microaerofilia (frasco con la vela), se investigan las campilobacterias termotolerantes, las colonias sospechosas son de color gris, brillantes, con aspecto de gota de agua, algunas pueden seguir la línea de siembra, adherentes, a las cuales se les practica una coloración de Gram con el fin de observar bacilos gramnegativos curvos, en forma de coma o con apariencia de alas de gaviota. La identificación de las especies más involucradas en trastornos diarreicos se realiza mediante la prueba de oxidasa (positiva) y las descritas en la Figura 20. Figura 20. Investigación de Campylobacter sp., especies más asociadas a problemas diarreicos PM
- Examen macroscópico: o Observar la consistencia (Sólidas, diarreicas, líquidas), el color, la presencia de sangre, pus, moco y restos alimentarios sin digerir. Apreciar el olor. -
- -- Frasco con heces (sin aditivos, ni torundas) o con jugo Duodenal A) Sangre oculta en heces El método más utilizado en el laboratorio es el test rápido en un solo paso en placa, se trata de un test rápido inmunocromatográfico cualitativo en fase sólida que permite la determinación de hemoglobina humana oculta en heces. La presencia de hemoglobina en heces puede ser un indicador de síndromes diarréicos invasivos, así, en la infección por Entamoeba histolytica el examen de sangre oculta en heces es siempre positivo. La membrana del test está sensibilizada con anticuerpos anti hemoglobina humana en la zona del test. Durante el ensayo las muestras reaccionan con el conjugado, absorbido en la membrana en la zona de carga de muestra, formando un complejo antígeno-anticuerpoconjugado, que migra a través de la membrana cromatográficamente por capilaridad. Si la muestra tiene hemoglobina se formará una línea rosada en la zona del test indicando un resultado positivo, si no aparece dicha línea el resultado será negativo. El complejo antígenoanticuerpo-conjugado seguirá migrando a través de la membrana hasta llegar a la zona de control, donde existen absorbidos anticuerpos anti-conjugado, formando siempre una línea rosada indicando una verificación interna del ensayo. Ilustración Hemoccult sensa blue control strip validates test results
- COLORACIÓN DE VAGO Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y
- El agar Yersinia CIN (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocina) permite el aislamiento selectivo de Yersinia enterocolitica. La selectividad de este medio se basa en la presencia de violeta cristal, Irgasan y sales biliares (inhibición de las bacterias Gram(+) y cefsulodin y novobiocina (inhibición de las bacterias Gram (-))
- las peptonas son fuentes de nitrógeno. D-Sorbitol es un carbohidrato fermentable. La mayoría de las cepas hemorrágicas de E. coli no fermentan Dsorbitol y producen colonias incoloras en agar MacConkey Sorbitol. Las sales biliares y el cristal violeta son agentes selectivos que inhiben el crecimiento de organismos gram positivos. El rojo neutro es un indicador del pH.
- Diarrea mediada por invasión de la mucosa intestinal y presencia de respuesta inflamatoria. Este tipo de diarrea se manifiesta con presencia de leucocitos fecales, fiebre y leucocitosis sanguínea. Debido a que la invasión bacteriana se limita a las capas superficiales de la mucosa intestinal, los pacientes usualmente no presentan bacteriemia. Las bacterias más comúnmente responsables de este cuadro infeccioso son: Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp. Y Escherichia coli enteroinvasiva
- Campylobacter es un bacilo, microaerofílico, Gram negativo, muy móvil, de cultivo lento y con una temperatura óptima de crecimiento de alrededor de 37-42ºC. Estas características dificultan su aislamiento y por ello se le considera un agente de “cultivo fastidioso
- Si la H pylori está presente, las bacterias convierten la urea en dióxido de carbono, el cual se detecta y se registra en su respiración exhalada después de 10 minutos. Este examen puede identificar a casi todas las personas que tienen H pylori.
- Normalidad ALT EVOLUCION DEL VHB