Manual inmunología aplicada

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 1
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

MANUAL DE PRÁCTICAS
DEL
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA APLICADA

Profesores de Laboratorio
Dra. María del Carmen Oliver Salvador
M. en C. Paola B. Zárate Segura
Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos
M. en C. Rodrigo Balam Muñoz Soto
IBT Héctor Molina Jiménez
IBT Hernán Cortés Arroyo

OCTUBRE 2008


ÍNDICE GENERAL

PRÁCTICA 1. TIPIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS 4

PRÁCTICA 2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN 8

PRÁCTICA 3. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN 14

PRÁCTICA 4. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD 18

PRÁCTICA 5. DETERMINACIÓN DE REACCIÓN Ag-Ac POR

ELECTROTRANSFERENCIA 20

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

El laboratorio representará el 30% de la calificación final de la materia de Inmunología
Aplicada.
La calificación de laboratorio se distribuirá de la siguiente manera:

1. TRABAJO PRÁCTICO 40%
- Asistencia al laboratorio.
- Puntualidad. Se dará un máximo de tolerancia de 10 minutos.
- Manutención de los conejos. Se evaluará la limpieza del bioterio así como
el cumplimiento y la responsabilidad de los conejos diariamente.
- Cada alumno deberá presentarse a la sesión de laboratorio con bata y con
el manual de prácticas engargolado en el cual deberán anotar todos los resultados
obtenidos en las prácticas.
No se permitirá el acceso al laboratorio si no se cumple este requisito.
- El material se entregará una vez llenado de manera correcta el vale
correspondiente.
- El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estará regido por el
reglamento general del laboratorio de biotecnología.

2. INFORME POR EQUIPO 40%
Este porcentaje se divide en:
- Introducción 10%
- Objetivo
- Resultados 15%
- Discusión de resultados 20%
- Cuestionario 20%
- Conclusiones 30%
- Referencias 5%
(diferentes a las mencionadas en la práctica)

3. EXAMEN DE LABORATORIO
Consistirá en una evaluación del conocimiento adquirido durante las prácticas

PRÁCTICA 1

TIPIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS

1. INTRODUCCIÓN

SISTEMA ABO
Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antigénicas determinadas
genéticamente, las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos específicos. El
primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, y le llamó
sistema ABO, el cual consiste en que un individuo tiene en sus glóbulos rojos uno, dos o
ninguno de los dos antígenos (A y/o B) pertenecientes a este sistema. Así, los individuos
pueden ser del tipo A, si solamente poseen el antígeno A; del tipo B, si únicamente tienen
el antígeno B; del tipo AB si poseen ambas, o del tipo 0 si no tienen ninguno de los dos.
La naturaleza química de los determinantes antigénicos es polisacarídica.
Aproximadamente el 85% de la población posee sustancias con características
antigénicas y estructurales similares a las presentes sobre las membranas de los
eritrocitos en prácticamente todas las secreciones corporales. A estos individuos se les
llama secretores.
Los carbohidratos que forman estructura antigénica A y B en la membrana de los
glóbulos rojos, también están presentes en otros materiales biológicos como bacterias,
alimentos y otros agentes ampliamente distribuidos que constituyen un persistente
estímulo. Los humanos reaccionan a este estímulo produciendo anticuerpos contra
aquellos antígenos que no forman parte de su propia estructura celular. Por esta razón, el
anticuerpo anti-A se produce en personas del grupo AB, que contienen ambos antígenos,
no forman dichos anticuerpos. A estos anticuerpos se les llama isohemaglutininas.

Sistema Rh

En 1939. Levine y Stetson reportaron el caso de una mujer con severa reacción
hemolítica después de la transfusión sanguínea proveniente de su esposo. El antígeno
responsable fue diferente de los ya conocidos en la época.
En 1940, Landsteiner y Winier inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos de
monos Macacus rhesus, basandose en la suposición de que en los eritrocitos de estos
monos podrían existir antígenos similares a los de los humanos. El suero obtenido
aglutinaba los glóbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la población humana
blanca.
Hasta ese momento todo sugería que el supuesto antígeno hallado por
Landsteiner y Wiener en monos, y el supuesto antígeno descrito por Levine y Stetson en
humanos, era el mismo. Posteriores investigaciones demostraron que los supuestos
antígenos eran diferentes; se determinó que la mayoría de los humanos tienen el antígeno
del mono rhesus y además otro diferente, pero relacionado. A sugerencia de Levine, se
conservó la demostración del factor Rh para el antígeno humano, y se le asignó el nombre
de LW al antígeno común al hoimbre y al mono.
A mediados de la década de los 40, se habían identificado cinco antígenos como
pertenecientes al actualmente denominado Rh. Estos cinco antígenos (C, c, D, E, e) se
combinan entre sí, dando lugar a diversos patronesantigénicos. El D tiene dominancia
antigénica. Los individuos que presentan el antígeno D en sus eritrocitos se denominan
Rh(+), y aquellos que no tienen el antígeno D se denominan Rh(-).

Además de los sistemas AB0 y Rh pueden ser detectados otros sistemas
antigénicos de la membrana de los eritrocitos (Lewis, Duffy, MN, Ss. Li, etc). Estos
sistemas se consideran secundarios.
El conocimiento de los antígenos sanguíneos ABO y Rh. Como antígenos
celulares importantes en transfusiones sanguíneas, en medicina legal y en la
isoinmunización materno-fetal.
Los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM. Por lo que son
altamente aglutinantes y fijadores de complemento. Por este motivo, la determinación de
este sistema es de gran relevancia en transfusiones sanguíneas.
2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar el sistema ABO y Rh de diferentes muestras.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Realizar la extracción sanguínea por jeringa
2.2.2 Realizar la tipificación sanguínea del sistema ABO

3. MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 Material por grupo
Centrífuga clínica
Baño maría a 37°C

3.2 Material por equipo
1 Frasco de torundas de alcohol
2 portaobjetos
3 pipetas Pasteur
Jeringa desechable de 5 mL con aguja de 21x32mm
2 tubos de ensaye de 13x 100mL
1 pipeta serológica de 5 mL
1 pipeta serológica de 1 mL
5 palillos de madera
Sueros tipificadotes anti-A, anti-B, anti-AB
Solución de albumina bovina al 25%
Eritrocitos humanos tipo A, B y 0, en suspensión al 5%
2 tubos de ensaye 10 x 75mm
Tubo con tapón de rosca
Suero tipificador anti-D comercial
Solución salina al 0.85%
Suero de Coombs

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1. Tipificación Sanguínea

1. Obtener aproximadamente 5 mL de sangre venosa y colocarla en un tubo sin
anticoagulante, permitir que se retraiga el coágulo incubando a 37°C 10 min y centrifugar
para separar el suero del paquete celular.

2. Rotular una placa o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B, anti-AB y
testigo. Rotular otra placa diferente con: A, B y 0.
3. Del mismo tubo donde se dejó coagular la sangre, con una pipeta pasteur tomar
eritrocitos del fondo (de los no atrapados en el coágulo). Colocar una gota de esta
suspensión en el portaobjetos que tiene las marcas anti A, anti-B, anti-AB y testigo.
4. Cerca de cada gota, adicionar una gota de suero comercial anti-A, anti-B y anti-
AB, según corresponda y en el lugar marcado como testigo, colocar una gota de la
solución de albúmina al 25%. Mezclar primero suavemente con un palillo y después con
movimientos rotatorios.
5. Buscar la presencia de aglutinación antes de 25 seg.

Por ejemplo, si se observa el siguiente resultado:

Anti-A Anti-B Anti-AB Testigo
Aglutinación - + + -

Esto indicaría que los eritrocitos probados corresponden al grupo sanguíneo B.
6. Para buscar las isohemaglutininas, en la otra placa marcada como A, B y 0,
colocar una gota del individuo frente a las marcas y agregar cerca una gota de eritrocitos
previamente tipificados de tipo sanguíneo A, B y 0, según corresponda.
7. Mezclar suavemente, primero con ayuda de un palillo y después con
movimientos rotatorios.
8. Buscar la presencia de aglutinación.

Resultados.
De acuerdo al ejemplo anterior, los resultados esperados para confirmar el grupo
sanguíneo serían:
A B 0
Aglutinación + - -

Por lo que el individuo correspondería al tipo B.
En el sistema ABO el grupo sanguíneo esta dado por la siguiente tabla.

Reacción de los eritrocitos con antisueros Reacción con el suero con antígenos Grupo
comerciales conocidos sanguíneo
Anti-A Anti-B Anti-AB A B O
+ - + - + - A
- + + + - - B
+ + + - - - AB
- - - + + - O

En caso de que se presente aglutinación en el testigo, se debe a que existen
autoanticuerpos antieritrocitos y esto DEBE de ser reportado inmediatamente.

4.2. Sistema Rh
De este sistema por su mayor inmunogenicidad, sólo se determina de forma
rutinaria el antígeno D en caso de requerirse una transfusión sanguínea. Por la
naturalez proteica del antígeno, los anticuerpos inducidos son de clase IgG que
pueden atravesar placenta y causar hemólisis intrauterina en caso de incompatibilidad
materno-fetal.

1. Con una pipeta Pasteur colocar cuatro gotas de sangre en un tubo con tapón de
rosca que contenga 2 mL de SS.
2. Marcar dos tubos: Rh y Testigo, colocar una gota de eritrocitos en cada uno.
3. Al tubo Rh adicionar una gota de suero anti-D y agitar suavemente.
4. Al testigo adicionar SS y agitar suavemente.
5. Centrifugar 1000 rpm 60seg
6. Buscar aglutinación, en caso de que el tubo Rh presente es Rh(+)
7.Si no hay en ninguno incubar a 37°C, 20 min y lavar 3 veces con SS centrifugando a
1500 rpm 2 min. Después de la última centrifugación remover el sobrenadante y
adicionar al paquete celular dos gotas de suero de Coombs.
8. Resuspender suavemente y centrifugar ambos tubos a 1000 rpm 60 seg.

Resultados.
Presencia de aglutinación.
Rh con aglutinación corresponde al grupo Du Rh(+), en caso negativo Rh(-).
Testigo debe ser negativo, en caso opuesto es autoinmune. Para transfusión el sujeto
clasificado como Du, se considera como donador Rh (+) y receptor Rh (-).

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. Bird, G. W.G. and Cunningham, J. 1977. “Agglutination and agglutination-
inhibition”. Techniques in Clinical Immunology. R.A. Ed. Thompson, Black Scientific
Publications. Oxford.
2. Dodd, B.E. and Lincoln, P.J. 1975. Blood Group Topics. John Turk Editor. Year
Book Medical Publishers, Inc.Chicago.


PRÁCTICA 2

ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN

1. INTRODUCCIÓN.

La Inmunización es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo
competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmunógeno. El
tipo y magnitud de la respuesta producida se deben a múltiples variables entre ellas se
encuentra: la inmunogenicidad de un antígeno, que depende de su complejidad
estructural, peso molecular, conformación y naturaleza química, dosis, vía de
administración etc.
La síntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra moléculas específicas que el organismo
no reconoce como propias (determinantes antigénicos), para que esta síntesis ocurra,
primero debe existir un contacto entre las células encargadas de la síntesis y el
determinante antigénico, contacto que es mediado por algunas células involucradas en la
respuesta celular.
Cuando un organismo se expone a un antígeno desconocido, el sistema inmune puede
requerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos. Al final de la
infección la concentración alcanzada de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llama
primaria. Cuando el organismo se expone posteriormente al antígeno, la respuesta ocurre
mucho más rápido y la concentración alcanzada, es apreciablemente mayor, en este caso
se habla de respuesta secundaria.
La aplicación práctica de los antisueros es muy diversa, pues se puede utilizar con fines
terapéuticos (inmunización pasiva), en diversos estados infecciosos o tóxicos (neumonía
lobar, tétanos, etc.). Además son útiles en la identificación de microorganismos aislados
de procesos infecciosos y en la clasificación taxonómica de diversas especies. También
han servido como herramienta de trabajo para dilucidar mecanismos inmunológicos
básicos (especificidad inmunológica, activación del complemento, fagocitosis,
citotoxicidad, etc.) y en la determinación rápida y específica de la naturaleza de diversas
sustancias químicas (proteínas, carbohidratos, haptenos, etc).

ADYUVANTES INMUNOLÓGICOS

Son sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterogénea
si se toman en consideración su origen, naturaleza química y actividad biológica
específica; Como los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2
funciones fundamentales: la estimulación de la resistencia no específica del huésped
contra las enfermedades infecciosas y el cáncer; y, por otra parte, la potenciación de la
inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de
laboratorio durante la inmunización experimental con vistas a la producción de antisueros.
Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antígeno o inyectados
simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra
una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos
específicos. El aumento de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios de
los siguientes procesos:

a) Incremento de la producción de anticuerpos específicos frente a un antígeno
vacunal.

b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciación de su
función neutralizante, germicida, opsonizante etc.
c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por células
T.
d) Generación de una respuesta humoral y/o celular de mayor duración.
e) Generación de una respuesta incrementada de memoria inmunológica.

Algunos adyuvantes son en si antigénicos (endotoxinas de bacterias gramnegativas,
como Bordetella pertussis, o algunas bacterias grampositivas y el género de las
micobacterias, etc.) mientras que otros no lo son (tartrato de alumínico de potasio o
alumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores,
polinucleótidos y otros).
El adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol o
Nujol) con un detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por
ejemplo, Arlacer-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freud
(FCA) contiene además del aceite y el detergente, una micobacteria (M. tuberculosis, M.
bovis u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la bacteria, peso seco, por cada
mL de la mezcla incompleta de Freund). Este ha sido utilizado durante más de 50 años en
la producción de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se dispone
de cantidades limitadas de antígenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. La
gravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos por
encontrar opciones igualmente efectivas y menos tóxicas no han resultado del todo
exitosos. Con los avances alcanzados en numerosas áreas de las ciencias biológicas y el
creciente interés por el bienestar de los animales de experimentación, existe una
considerable presión para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en la
actualidad con alternativas definitivas para este adyuvante, en diferentes estudios
comparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor número
de efectos adversos y mayor facilidad en la manipulación.

En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante Freund completo e
incompleto ya que frecuentemente su aplicación conduce al desarrollo de granulomas
severos.

VÍAS DE INMUNIZACIÓN.

Se pueden emplear vías tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa,
intracardiaca, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, etc.
El estado físico del antígeno (particulado o soluble) debe tenerse en cuenta para escoger
la ruta de inmunización; es decir, los antígenos particulados por lo general son
introducidos por vía intravenosa, mientras que los antígenos en solución pueden
introducirse por otras vías como la intramuscular, la intraperitoneal, la subcutánea o la
intradérmica. En estas dos últimas vías preferentemente se utiliza al antígeno
acompañado con adyuvante.
La mayoría de las veces sólo se logra una respuesta adecuada llevando a cabo más de
un estímulo antigénico, asegurando así que se obtendrán títulos altos de anticuerpos o el
número deseado de células específicas estimuladas.

2. OBJETIVOS.

2.1. OBJETIVO GENERAL.
Desarrollar diferentes esquemas de inmunización en animales.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
2.2.1. Desarrollar esquema de inmunización en conejos raza Nueva Zelanda
2.2.2. Desarrollar el esquema de inmunización para diversos antígenos

3. MATERIALES Y REACTIVOS.

3.1 Material por Grupo.
Centrífuga clínica.
Baño María a 37°C.
3.2. Material por Equipo.
Antígeno suficiente para inmunizar a conejos, de acuerdo al protocolo de
inmunización.
Un conejo que no rebase 5 Kg. de peso (de preferencia de color blanco, para
facilitar la localización de la vena marginal de la oreja).
Adyuvante incompleto de Freund.
Jeringas de 1 mL con aguja de 25x16 (5/8) mm.
Un lienzo para sujetar al conejo.
Un frasco con torundas de algodón y alcohol al 70%.
Frasco de solución salina fisiológica estéril (0.85%).
Mechero Bunsen.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.

4.1 TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA

Para todos los antígenos el sangrado se hace antes y después de la última inmunización,
tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado previo es
indispensable para contar con un suero testigo.

Venosa.
1. Inmovilizar al animal.
2. Tomar la oreja.
3. Limpiar la zona de la vena lateral con alcohol al 70%.
4. Sujetar y colocar una torunda con agua tibia para ayudar a la exposición del a
vena.
5. Hacer un corte con una navaja de bisturí estéril de 2mm de longitudinalmente a
la vena y colectar 2 mL por goteo en un tubo sin anticoagulante.
6. Una vez colectados los 2mL, colocar un vendolete en la oreja.

Antes de iniciar el esquema de inmunización correspondiente. Dejar coagular la
muestra sanguínea y separar el suero por centrifugación. Este suero, será el
testigo, debe ser conservado en un tubo de ensayo, sellado y rotulado
adecuadamente, en congelación, hasta que se concluya con el esquema.

4.2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN.

A. mexicaina (Proteasa de origen vegetal, extraída, tratada y purificada)

Inyección Tiempo Dosis Vía
(Días) (mg)

1 0 0.5 El antígeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85%
emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto
de Freund vía intradérmica o subcutánea.
2 15 0.5 Se sigue el mismo procedimiento de la primera
inmunización pero usando el adyuvante incompleto
de Freund, por vía subcutánea o intradérmica.
3 30 0.5 En SS 0.85%, por vía subcutánea o intradérmica.
Sangrado 39 -- Vía intravenosa o intracardíaca para la obtención
del antisuero.

SS = Solución Salina

Nota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación por
densitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford.

A. Papaína (Proteasa de origen vegetal, extraída, tratada y purificada)

(Días) (mg)
1 0 0.5 El antígeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85%
emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto
de Freund, por vía subcutánea o entradérmica.
del antisuero.



B. Salmonella entérica transformada con plásmidos pL-STPN.
Las cepas fueron sembradas en tioglicolato durante 10h para inducir la
expresión de las proteínas, la inoculación se realizara en concentraciones de
1x 10 5 celulas/mL.


(Días) (mg)
1 0 0.5 El antígeno se disuelve en 0.5mL de SS al 0.85%
emulsificando con 0.5mL de adyuvante incompleto
de Freund, por vía subcutánea o intradérmica.


del antisuero.


4.2. Una vez terminado el esquema de inmunización en cada caso, realice un gel de
electroforesis de poliacrilamida utilizando muestras del suero testigo, del suero obtenido
después de terminado el esquema de inmunización y de los antígenos utilizados. Colocar
el siguiente orden en el gel.
1. Marcador de peso molecular.
2. Antisuero del conejo antes de iniciar el esquema de inmunización.
3. Antisuero del conejo una vez concluido el esquema de inmunización.
4. Antígeno inyectado.
5. Estandar de IgG de conejo.
4.3. Cuantificar por medio de densitometría la proporción de IgG obtenidas. (% pureza).
4.4. Reportar el gel final como resultado de esta práctica.

5. CUESTIONARIO.
5.1 ¿Qué es un antígeno soluble y qué es un antígeno partículado?
5.2 ¿Por qué se utilizan las diferentes vías de inmunización para los antígenos?
5.3 Investigue la importancia del uso de adyuvantes en la vacunación, los principales
tipos de adyuvantes y su mecanismo de acción, así como restricciones de uso.
5.4 Cite 5 tipos de antígenos utilizados para la inmunización de animales,
describiendo la naturaleza del antígeno, la vía de inmunización que se utiliza y
especie de animal en que se desarrolla.
5.5 . Investigue las nuevas vías de administración de proteínas para generar
respuesta inmune.
5.6 . Explique de que depende el desencadenamiento un tipo específico de
respuesta inmune (no específica, humoral o celular) en un organismo.
5.7 . Investigue el peso molecular de las IgG y compare los resultados obtenidos en
el gel de acrilamida.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
6.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de técnicas modernas en Inmunología.
Teoría y práctica. 1ª. Edición. INDRE-SSA. México.
6.2. Manual de laboratorio de Inmunología. (1998). Departamento de Inmunología. Escuela
Nacional de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.

6.3. Biotecnología Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.
6.4 Grupta R., Relyveld E., Lindblad B., Bizzine B., Ben-Efraim S. and Grupta C (1993).
Adjuvants-a balance between toxicity and adjuvancicity. Vaccine (11):293-306.


PRÁCTICA 3

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

1. INTRODUCCIÓN

La reacción de la precipitación se presenta cuando un antígeno multivalente en estado
soluble, se une con su anticuerpo específico y así da lugar a la formación de un complejo
insoluble. Esta reacción se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antígenos y
anticuerpos y se puede llevar a cabo en medio de líquido o semisólido.
La precipitación en medio líquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera,
sólo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitado
formado se le determina la concentración de proteínas totales por métodos
espectrofotométricos o bien por el análisis de nitrógeno proteico empleado en el método
de Kjelndahl.
Cuando la reacción se realiza en medio líquido, la cantidad de precipitado varía según la
proporción de los reactivos. Si se dispone de una serie de tubos capilares que contengan
el mismo volumen de suero y cantidades crecientes de antígeno, puede observarse que el
precipitado formado alcanza un máximo, después del cual, progresivamente, se encuentra
una disminución en la cantidad de precipitado.
Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correspondientes a los que
presentan un máximo de precipitación prácticamente no tienen antígeno ni anticuerpos,
en tanto, en los precedentes puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto,
la presencia de antígenos.
Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antígeno
agregado y en el eje de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva,
generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres regiones.

La reacción de precipitación en medio semisólido, se efectúa en un gel y se conoce como
inmunodifusión. Esta consiste en la difusión, a través de un gel, de un antígeno, y su
anticuerpo homólogo con la consiguiente aparición de una banda de precipitado en el sitio
donde se alcanzan las concentraciones óptimas de ambos reactivos.

La velocidad de la difusión depende de la forma, tamaño y la concentración de las
moléculas precipitantes, así como de la temperatura a la cual se realice la reacción.
Cuando se tienen dos o más tipos de moléculas, éstas se pueden difundir a diferente
velocidad. En el sitio donde se localicen zonas de concentración óptima de antígeno y de
anticuerpos se formarán bandas de precipitación.

Existen diferentes tipos de inmunodifusión; aquel en el que ambos reactivos difunden
libremente en el gel es llamado doble difusión o método de Ouchterlony, el cual puede
tener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinación de la posible relación
inmunológica entre dos antígenos y del número de sistemas antígeno-anticuerpo
presentes, así como la semicuantificación de un antígeno o de un anticuerpo.

Otra variante en la que sólo uno de los reactivos (generalmente el antígeno) difunde en el
gel, donde se haya embebido el otro (generalmente el antisuero), se conoce como
imunodifusión simple. En la imunodifusión radial se aplica este principio para determinar
cuantitativamente la concentración del antígeno, éste se encuentra en una concentración
inicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que se van difundiendo, la

concentración disminuye hasta que, en el sitio donde los reactivos están en proporciones
óptimas, se forma un halo de precipitación cuyo diámetro tiene relación directa a la
concentración del antígeno.
La técnica de imunoelectroforésis fue propuesta por Grabar y Williams quienes
combinaron las técnicas de electroforesis y de inmunodifusión para separar y determinar
la presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antigénicas.
Primeramente, los componentes de la mezcla son separados por la aplicación de una
corriente eléctrica y posteriormente, se hacen reaccionar con sus anticuerpos específicos,
con los que se realiza la precipitación. Esta prueba es ampliamente utilizada para
determinar la pureza de sustancias antigénicas.
En la contra–inmunoelectroforesis, los antígenos y sus anticuerpos simultáneamente se
someten a la acción de un campo eléctrico en un gel a Ph de 8.6. En estas condiciones,
los anticuerpos casi no tienen carga, por lo que no se desplazarán bajo el efecto de la
corriente eléctrica, sin embargo, se mueven hacia el cátodo debido al flujo endosmótico
del regulador usado.
Los antígenos que poseen carga negativa migran hacia el ánodo y mediante la
disposición apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antígeno y el
anticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitación en poco
tiempo, dependiendo de la concentración y de la velocidad de migración de los reactivos.
Obviamente, este método no es aplicable a antígenos con carga positiva o neutra.

2. OBJETIVOS.

2.1. OBJETIVO GENERAL.
Evidenciar la reacción de precipitación que se lleva a cabo cuando hay interacción
entre antígeno soluble con anticuerpo homólogo.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Desarrollar la técnica de precipitación en capilar para la cuantificación de los
anticuerpos presente en un antisuero específico.
2.2.2 Valorar la reacción de precipitación


3.1Material por equipo.
- 11 tubos capilares de 100 mm de largo y de 1.6 a 1.8 mm de diámetro.
- 8 tubos de ensaye de 13 x 100mm.
- 8 pipetas de 1.0 ml.
- 1 gradilla de plastilina.
- Papel absorbente.

3.2 Reactivos
- 5 ml. de solución salina isotónica.
- 1.0 ml. de solución de antígeno que se desea probar.
- 1.0 ml. del antisuero correspondiente.
- Antisuero del conejo obtenido antes de empezar el esquema de inmunización.


4.1. PRECIPITACION EN CAPILAR.

1. Se toman 7 capilares y con ayuda de un marcador se marcan a a un volumen de
0.5 mL y 1 mL
2. En 7 tubos de ensaye de 13 x100 mm debidamente rotulados, se hacen diluciones
seriadas de la solución de antígeno:
a) Se colocan 0.5 ml de solución salina en cada uno de los tubos de ensaye.
b) Al tubo 1 se le agrega 0.5 ml de la solución del Ag, se mezclan bien con la misma
pipeta (dilución 1: 2).
c) Con una pipeta diferente se toman 0.5 ml del tubo 1 y se pasan al tubo 2, se
mezclan bien con la misma pipeta (dilución 1: 4)
d) El procedimiento se repite para los tubos siguientes (dilución 1:8 a 1:128).

3. Se toma un tubo capilar y por capilaridad se absorbe un volumen tal de antisuero
que llegue hasta la primera marca. La parte externa del capilar se limpia con papel
absorbente (papel filtro grueso).
4. El tubo capilar se gira ligeramente y se hace descender el volumen de antisuero
hasta el otro borde.
5. Por el extremo en el que se encuentra el antisuero en seguida se absorbe la
cantidad necesaria de antígeno sin diluir (dilución 1:1), de tal modo que el volumen
total llegue hasta la siguiente marca del tubo. Se limpia la parte externa con papel
absorbente.
6. Es necesario realizar dicha operación con sumo cuidado, evitando que el antisuero
se salga del capilar y contamine el antígeno.
7. Con el dedo índice se tapa uno de los extremos del capilar y se deja que el
contenido quede centrado en el capilar.
8. Un extremo se introduce en una barra de plastilina.
9. Se repite el procedimiento señalado en los incisos de 3 al 8 usando cada una de
las diluciones del antígeno (de 1:2 a 1:128).
10. Un capilar se llena hasta la segunda marca con antígeno sin diluir y otro, en la
misma forma, únicamente con antisuero. El primero es el testigo del antígeno y el
segundo es el del anticuerpo.
11. Se dejar reposar y al término de la práctica a temperatura ambiente, si no hay
reacción aparente se guardan en el refrigerador y observar a las 12 y 24 horas.
12. Se mide la cantidad de precipitado en milímetros.

4.2 PRECIPITACION EN CAPILAR.
Observe cuidadosamente la serie de tubos capilares y mida la altura de la columna
de material precipitado en aquellos en que se encuentre. Con estos datos complete una
tabla que contengan los siguientes datos: Numero de tubo, factor de dilución,
concentración del antígeno y altura de la columna.

Numero de Capilar Dilución del antígeno Concentración del Precipitación en mm
antígeno
1 1:1
2 1:4
3 1:16
4 1:64

5. CUESTIONARIO
• Que metodologías actuales se pueden aplicar para medir la reacción antígeno-
anticuerpo.


• Desarrolle un esquema para cuantificar la reacción antígeno anticuerpo en el
laboratorio.
• Qué sugerencias tiene para optimizar la práctica.
• A nivel comercial que pruebas biológicas-clínicas se utilizan en la reacción Ag-Ac?

6. REFERENCIAS.
7.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de técnicas modernas en Inmunología.
Teoría y práctica. 1ª. Edición. INDRE-SSA. México.
7.2. Manual de laboratorio de Inmunología. (2). Departamento de Inmunología. Escuela
Nacional de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.
7.3. Biotecnología Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.
7.4. Mueller UW, Hawes CS, Jones WR. Monoclonal antibody production by hybridoma
growth in Freund´s adjuvant primed mice. J. Immunol. Methods 1986; 87:193.


PRÁCTICA 4

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD

1. INTRODUCCIÓN

El método de Bradford, (1976) involucra la unión del azul brillante de Coomassie
G-250 a la proteína. Esta unión provoca un cambio en el máximo de absorción de 465 a
595 nm y este incremento a 595 nm es el que se cuantifica. Dicha unión es independiente
de la composición de aminoácidos de las proteínas.

2. OBJETIVO

2.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar de manera cuantitativa el anticuerpo producido, para realizar la
inmunodetección en medio sólido “western blot”

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Cuantificar el anticuerpo producido por la técnica de Bradford

Determinar la variación de las muestras


3.1 Material por equipo.
- Espectrofotometro
- celdas de cuarzo para leer
- tubos tipo ependorff
- 1 gradilla
- Micropipetas
- Puntas

3.2 Reactivos
- Reactivo de Bradford
- Suero del conejo obtenido después el esquema de inmunización.


Se determina la concentración de proteínas, por medio de una curva tipo con BSA
y el reactivo de Bradford, como se indica abajo:

(BSA) 200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25
µg/mL (mL)
Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0
(mL)
Reactivo de 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
Bradford (mL)


Concentración 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
de BSA µg/mL)

Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Después de 5 min de agregado el
reactivo de Bradford, se lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con un “blanco
de reactivos” (el que no contiene proteína) y se calcula la ecuación de la recta.

La cantidad de proteína contenida en la muestra se determina interpolando el dato de
absorbencia en la curva tipo elaborada con la albúmina de suero de bovino a diferentes
concentraciones. Se utiliza la ecuación obtenida de la curva tipo

ANEXOS

Preparación del reactivo de Bradford: 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 se
disuelven en 50mL de etanol al 95%. A esta solución se le añaden 100 mL de ácido
fosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se diluye a un volumen final de 1litro. Las
concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanol
y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:
248-254. 1976.
• Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69
(1990).


PRÁCTICA 5

DETERMINACIÓN DE REACCIÓN Ag-Ac POR ELECTROTRANSFERENCIA

1. INTRODUCCIÓN

La técnica de inmunoelectrotransferencia (IET), descrita por Towbin et al en 1979, es uno
de los métodos más útiles con que se cuenta para el análisis antigénico (Peferoen et al,
1982). Esta metodología combina el poder resolutivo de la electroforesis en geles de
poliacrilamida (PAGE), en presencia o en ausencia de detergentes como el docecil sulfato
de sodio (SDS), con las reacciones inmunoenzimáticas en fase sólida. Las proteínas
separadas por pesos moleculares son electrotransferidas a membrana de nitrocelulosa
(NC) o de Nylon, en donde se unen a los grupos reactivos de éstas, quedando
inmovilizadas y expuestas en la superficie para reaccionar con los anticuerpos
correspondientes. El patrón que se obtiene sobre el papel de NC es una copia del patrón
de separación obtenido en el gel. Posteriormente de bloquean los sitios reactivos del
papel de NC que quedan libres, con alguna proteína que no interfiera y a continuación se
hace reaccionar con los anticuerpos problema, los cuales podrán unirse a sus antígenos
correspondientes inmovilizados en el papel (Brunete, 1981). La siguiente reacción que se
efectúa corresponde a la primera interacción antígeno-anticuerpo, que se pone de
manifiesto al agregar un segundo anticuerpo unido a una enzima como peroxidasa u otro
conjugado como proteína A de Staphyloccocus aureus igualmente marcada.
En el ensayo enzimático se agrega el sustrato y un cromógeno que precipiten in situ para
hacer visible la reacción. Se puede identificar la clase de respuesta inmunológica del
huésped (IgM, IgG, IgA, IgE), usando el conjugado correspondiente.

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL.
Cuantificar el anticuerpo producido, para realizar la inmunodetección en medio sólido
“western blot”

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Determinar la presencia del antígeno por medio de la técnica de
electrotransferencia.
2.2.2 Realizar la transferencia y detección por unión especifica.
2.2.3. Corroborar que el esquema de inmunización se llevo de la manera adecuada


3.1. Material por equipo.

Cámara de electrotransferencia
Fuente de Poder
Papel filtro Whatman 3mm
Papel de Nitrocelulosa
Ambos papel de nitrocelulosa y papel filtro hay que cortarlos del mismo tamaño del gel de
porteinas (SDS-PAGE).
Vasos de precipitado

Micropipetas
Matraces aforados
Matraces erlenmeyer

3.2. Reactivos

Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Amortiguador del gel separador pH 8.8
Amortiguador de corrida 5X / SDS
Amortiguador de muestra pH 6.8
Persulfato de amonio al 10%
Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL
Sol. teñidora
Sol. desteñidora

Amortiguador de electrotransferencia [25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 20% (v/v)
metanol, 0.01% (w/v) SDS, pH 8.3].
Solución salina de fosfatos 0.01M, NaCl 0.15M, pH 7.2 (PBS)
Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20,, 0.05%)
Rojo de Ponceau [0.2% en ácido tricloroacético 3%]
Solución de bloqueo
Solución cromógeno /sustrato


4.1 Tratamiento de las muestras

5. A la muestra de proteína con concentración conocida se lleva a un volumen de 85 L
con amortiguador de muestra. Adicionar con 10 L de la sol. de azul de bromofenol y 5 µL
de β-mercaptoetanol.
6. Poner a ebullición durante 5 minutos y enfriar.

4.2 Procedimiento para el gel de SDS-PAGE

7. Limpiar con etanol al 70% las placas de vidrio.
8. Colocar el juego de placas de vidrio y separadores en la base para preparar el gel.
9. Preparar el gel separador con forme a la Tabla 1, considerando que al final se adiciona
el TEMED y Persulfato de amonio para vaciar en la cámara de electroforesis. Vaciar el gel
separador evitando la formación de burbujas hasta dejar un espacio de 3 cm a partir del
borde superior de los vidrios (Tabla 1).

Tabla 1.Gel separador para 15 mL

Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5
Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05


TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

10. Dejar polimerizar de 20-30 minutos
11. Preparar el gel concentrador como lo índica la Tabla 2, vaciar en la parte superior del
gel.

Tabla 2. Gel concentrador para 2 mL

Sol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26 mL
Amortiguador pH 6.8 0.5 mL
Agua desionizada 1.22 mL
Persulfato de amonio 0.01 mL
TEMED 0.002 mL

3. Colocar el peine con cuidado de no formar burbujas y dejar polimerizar por 20 min.
4. Preparar las muestras y el marcador de peso molecular.
5. Montar las placas de vidrio en su base y ésta en la cámara de electrofóresis.
6. Preparar el amortiguador de corrida al 1X.
7. Llenar la cámara interna con amortiguador de corrida hasta el límite y la parte
externa hasta cubrir los electrodos.
8. Cargar el gel con las muestras y el marcador de peso molecular.
9. Tapar y conectar los electrodos a la fuente de poder.
10. Iniciar con un voltaje de 50 V hasta que las muestras pasen del gel concentrador,
posteriormente aumentar a 100 V hasta que el frente alcance la parte inferior del
gel.
11. Apagar la fuente de poder y recuperar el amortiguador de corrida (se puede
utilizar hasta 3 veces)
12. Desmontar la cámara y extraer con cuidado el gel. Colocar el gel en un recipiente
adecuado y teñirlo con la sol. correspondiente. Colocar en agitación orbital durante
1 hora aprox. Retirar el gel y sumergirlo en la sol. desteñidora hasta desteñir bien
el gel.

Una vez obtenido el gel SDS-PAGE, se sumerge en amortiguador de transferencia.

4.3 Preparación de la cámara y transferencia.

1.- Colocar fibras Scotch y papeles Whatman (grosor 0.16 mm) en un recipiente con
suficiente amortiguador de transferencia, 30 minutos antes de transferir.
2.- Cortar la membrana de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al tamaño del gel (utilizando
guantes) y colocarla en otro recipiente que contenga amortiguador de transferencia.
3.- Colocar dos fibras Scoth en un “cassette” para electrotransferencia, sobre las cuales
se colocan dos porciones de papel filtro teniendo cuidado que no queden burbujas
atrapadas entre los papeles; después colocar el gel y sobre este la membrana de NC;
eliminar las burbujas.
4.- Con un lápiz marcar el frente de electroforesis del gel, sobre el papel de NC y señalar
el número de carril de acuerdo a la colocación de las muestras, colocar otros dos papeles
filtros sobre la NC y otras dos fibras. Cerrar el “cassette” e insertarlo en el contenedor.
5.- Colocar el contenedor en la cámara y llenarla con el amortiguador de transferencia,
tapar y conectar los electrodos de tal manera que el ánodo (-) quede del lado del gel y el

cátodo (+) del lado de la NC; conectar a la fuente de poder y transferir durante 1 hora a
100 V, cuidando de que la temperatura del líquido no se eleve a más de 60° C.
6.- Al terminar la transferencia tomar la membrana de NC con guantes y colocarla en un
recipiente con solución para teñir (durante 20 minutos)
7.- Observar en la membrana si se distinguen las proteínas que fueros transferidas, lavar
con agua destilada para retirar el exceso de colorante y secar; si no se alcanzan a
distinguir las bandas teñir otros 20 min.

4.4 Reacción inmunoenzimática

1.- Colocar la membrana de NC en un recipiente que contenga 30-50 mL del amortiguador
de bloqueo e incubar 2 h a temperatura ambiente en agitación continua.
2.- Eliminar el exceso de solución de bloqueo por decantación y hacer 3 lavados con PBS-
Tween de 5 min. Cada uno con agitación continúa.
3.- Incubar la membrana con el suero o anticuerpo de interés a las diluciones establecidas
con anterioridad.
4.- Eliminar el exceso y lavar come en el paso 2.
5.- Posteriormente se agrega el conjugado correspondiente en la dilución apropiada con
PBS-Tween. Se incuba durante 2 h a temperatura ambiente con agitación continua.
6.- Se repite el paso 4.
7.- Por último se agrega la solución cromógeno/sustrato para dot-ELISA e
inmunoelectrotransferencia y se espera hasta que aparezcan las bandas; después se
enjuaga con agua desionizada y se deja secar.

ANEXOS

SOLUCIONES PARA GEL SDS-PAGE

Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4°
C. Usar guantes al pesar ya que la archilamida es un compuesto neurotóxico.

Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar
el pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de Glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada
y aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.

Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y
ajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el
volumen a 100 mL.

Persulfato de amonio al 10%

Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.

Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar
en refrigeración.

Sol. teñidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de
agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Commasie en el
metanol y adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.

Sol. desteñidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.

SOLUCIONES DE ELECTROTRANSFERENCIA

Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2M
y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200mL de metanol aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar
hasta 3 veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.

Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)
Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.
Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PB
se prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfato
de sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con
agua desionizada.

Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)
A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.

Solución de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20.
Guardar a -20° C.

Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%
Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 ml
con agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ambar.

Solución cromógeno / sustrato
Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS,
agregar 25 µl de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se prepara
inmediatamente antes de usarla.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Fundenberg, Hugh, Stites Daniel, Caldwell, Joseph, Wells, Vivian, Manual de
Inmunología clinica, segunda edición, editorial el Manual Moderno, Mexico, 1980, pp. 50-
60.
2. Towbin H., Staehelin, Gorgon J.. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl
Sci USA, 1979, 76:4350.
3. Peferoen M. R., Huybrechts R., De Loof A. Vaccum-blotting: A new simple and efficient
transfer of proteins from sodium docedyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose.
FEBS Lett. 1982, 145:369.

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