4. PCR
• Es una técnica molecular que permite
amplificar selectivamente una región
concreta de ADN que puede ser un gen o
un fragmento de ADN, de modo que
partiendo de cantidades iniciales
pequeñísimas (una sola copia) podrían
obtenerse varios miles de millones de
copias.
5. • El punto central de la técnica de PCR es la
síntesis de ADN desde un punto concreto,
repetida durante un número elevado de
veces(ciclos). Por lo tanto, hay dos elementos
esenciales de la técnica:
• Conseguir que la amplificación se limite
exclusivamente a la región genómica de interés
• Utilizar algún tipo de Polimerasa que permita
repetir el proceso de síntesis de ADN muchas
veces
6. Amplificación in vitro de DNA
• Herramienta imprescindible en BM, diagnóstico
de enfermedades infecciosas, genéticas,
medicina forense, determinación de paternidad,
criminalística
• El objetivo de esta técnica es amplificar
directamente un gen o fragmento de DNA o
indirectamente un RNA
• Es requisito imprescindible que se conozca
parte de la región a amplificar
7. La reacción de PCR en 3 pasos:
1. Desnaturalización: 94°C - 96°C
separa la doble hélice en 2 hebras sencillas, eliminación
de estructuras secundarias, tiempo depende del
contenido de G+C
2. Alineación o hibridación: Los partidores se unen a
sitios específicos en cada hebra del ADN, la
temperatura depende de la Tm de los partidores, varía
entre 50-65°C
3. Extensión o elongación: 68 - 72°C: La DNA polimerasa
adiciona los nucleótidos, al extremo 3´libre de los
partidores, usando como molde la secuencia original
8. Etapas opcionales de una reacción
de PCR
• Desnaturalización inicial
Al inicio de la reacción de PCR, su función es permitir una
mejor separación de las hebras de ADN, en particular
cuando el ADN presenta varias estructuras secundarias,
dura entre 3 a 5 minutos
• Elongación final
Esta etapa adicional permite que los fragmentos
amplificados puedan ser completamente extendidos, hasta
el tamaño que se quiere amplificar
• Mantención busca mantener la integridad de los
fragmentos amplificados, por lo que se agrega un paso
final a 4°C
15. DNA Molde, diana o blanco
DNA molde o templado
• Homogenizados
• Extractos crudos de tejidos
• Sangre, muestras clínicas en general
• DNA y RNA extraídos
• Mezclas de DNA obtenidos con Enzimas de
restricción
• Etc
Componentes de una reacción
de PCR
16. • Se necesitan cantidades mínimas de DNA
– Picogramos es suficiente 100 a 200ng
– Se puede detectar 1 sola bacteria (20 fgr de DNA)
• Funciona en mezclas complejas de DNAs
• No requiere purificaciones complicadas
• DNA parcialmente degradado
• INHIBIDORES
DNA molde
17. Componentes de una reacción de
PCR
• Agua libre de nucleasas (estéril)
• Catión divalente (MgCl2) cofactor de la
ADN polimerasa 1 a 4 mM
• Desoxinucleótidos (dNTP´s) 20 a 200uM
• Sol. amortiguadora (Buffer 10X) y sales
KCl 50 mM
• Oligonucleótidos (Partidores) 0.1-a 0.5uM
• Enzima (Taq Polimerasa)
18. Desoxinucleótidos dNTP´s
• Son 4 los dNTP´s involucrados en una PCR típica: dATP,
dCTP, dGTP, dTTP
• Provee de nucleótidos (base + azúcar + fosfato) a la reacción
para la síntesis de ADN
• Se incorporan un ADN molde de manera complementaria
para realizar una copia exacta
• Los dNTP´s pueden ser utilizados eficientemente en las
reacciones de PCR en forma de: dig-dUTP, biotin-dNTP´s,
ddNTP´s, fluorescent-dNTP´s, etc
20. Consideraciones para el diseño de
partidores para PCR
• Longitud de los partidores (usualmente 18-24
nts)
• Temperaturas de fusión Tm similares
(usualmente 44-55% G-C)
• Extremos ricos en GC
• Distancia entre partidores (ideal entre 150-
500 pb pero hasta 2 Kb)
21. Partidores
• Se conoce su secuencia
• Es el factor mas importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso
• Requieren de un cuidadoso diseño
• Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas (dímeros
de partidor)
(d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno del
otro
23. • Pol termoestables:
activas a 95ºC
óptimo a 72ºC
• No tiene actividad
exonucleasa 3´_5´
1 a 1.25 U en la reacción
100nt/seg.
• La enzima Taq polimerasa
fue aislada de la bacteria
Thermus aquaticus en
1976
• Esta bacteria vive en
ambientes con altas
temperaturas, las
enzimas que se extraen de
ella son termoestables
Taq Polimerasa
25. ADYUVANTES DE LA PCR
• Son elementos que mejoran el rendimiento y la
especificidad de la PCR.
• Se usa DMSO, glicerol o BSA.
• El adyuvante más utilizado es el BSA. A
concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el
BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya
actúa como una proteína captadora de iones
que pueden ser inhibidores de la Taq
polimerasa
26. • Condiciones para reacción en el
termociclador:
Desnaturalización inicial
1 ciclo : 94 C por 2.5 minutos.
desnaturalización
94 C por30 segundos
hibridación
54 C por1 minuto
elongación
72 C por 30 segundos los tres pasos
por 32 ciclos
Elongación final 1 ciclo 72 C por 10
minutos
27. Detección e Identificación
Criterio de IdentificaciónSistema de detección
Tamaño
Tamaño fragmentos
Tamaño + secuencia sonda
Secuencia sonda
Secuencia sonda
Secuencia completa
• Electroforesis
• Enzimas de restricción
• Hibridación
• Southern
• Dot blot
• Hibridación en líquido
• Secuenciación
28. Análisis de la Muestra
• Digestión de los productos amplificados ya
que poseen secuencias que son reconocidas
por enzimas de restricción.
• Se pueden aislar los productos amplificados
y someterlos a Hibridación, (Southern Blot)
• Secuenciación del producto amplificado
29. Análisis de la Muestra
• La detección del producto
de la PCR se realiza
normalmente mediante
electroforesis
• Dependiendo del tamaño
de la amplificación y la
resolución deseada, se
utilizaran diferentes
medios (agarosa,
poliacrilamida) a distintas
concentraciones.
30. Análisis de la Muestra
• La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción
de plata, fluorescencia, radioactividad, sybr
safe Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas
(primers inespecíficos se
pegan a varios sitios)
31. Hibridación en medio líquido
detección en placa
S
B
D D
E
Amplificado
marcado
Pocillo de poliestireno
1.- Hibridación
2.- Inmunodetección
Sustrato
Color
E
35. Ventajas y Desventajas de la PCR
DESVENTAJAS
• Contaminación
• Introducción de una
nueva tecnología
VENTAJAS
Alta sensibilidad
Alta especificidad
Poca muestra
Sin purificaciones
complicadas
Rapidez
Automatización
36. ¡¡Evitar la contaminación!!
• Contaminación muestra a muestra
– Utilizar material de un solo uso
(desechable)
– Utilizar pipetas con filtro
– Abrir los tubos uno a uno
– Utilizar soluciones decontaminantes
– Utilizar controles
37. Contaminación por producto
amplificado
– Separar FÍSICAMENTE las zonas de extracción
de ADN y análisis de amplificados.
– Utilizar material de laboratorio diferente en ambas
zonas.
– Evitar protocolos de PCR “nested”
– Utilizar métodos de descontaminación
• Luz UV
• HCl
• Enzimas: Uracil-N-Glycosylase (UNG)
– Utilizar reactivos pre-PCR ya preparados,
analizados y conservados en alícuotas.
38.
39. Controles de la reacción de PCR
• Control de reactivo
• Control negativo
• Control positivo
• Control interno: Competitivo
No competitivo
40. Materiales para PCR
• Termociclador “Thermo
cycler”
• Microcentrífuga
• Micropipetas de 2, 20 y
200 ul
• Microtubos para “PCR”,
estériles
• Puntas estériles
• Agua destilada,
desionizada y estéril
• ADN molde (ADN en
estudio)
• Partidores
• dNTP’s (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP de [25 μM]
c/u)
• 10X buffer para PCR
(Solución amortiguadora
para “PCR”)
• MgCl2 (25 mM)
• BSA
• Polimerasa Taq
45. RESUMEN
Diseño de un protocolo de PCR
• Amplificación
– Selección gen-pareja de oligos
• Sensibilidad
• Especificidad
– Optimización de PCR
• Límite de detección sobre DNA purificado
• Elección método de extracción DNA
– Límite de detección en muestras
• Elección método detección de amplificado
– Recursos
• Comparación del método de PCR con los métodos clásicos
– Fiabilidad del método
