Anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, humanización de anticuerpos, anticuerpos quimera, métodos de producción de anticuerpos monoclonales.

1. Anticuerpos Monoclonales
Daniel Goicochea
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología

2. • Anticuerpos policlonales resultantes de un
animal inmunizado pueden reconocer una
variedad de epítopes sobre el antígeno

3. Anticuerpos monoclonales (Köhler y
Milstein, 1975, 1976).
• Tecnología de hibridomas: fusionar un linfocito B
(información codificante para el anticuerpo) con
una célula de mieloma (célula plasmática
cancerosa: capacidad de multiplicación y
crecimiento ilimitado), para obtener un híbrido:
síntesis y secreción de un anticuerpo y
crecimiento perpetuo

5. Características de las células de
mieloma
• Haber perdido la capacidad de secretar
inmunoglobulina propia (Ig-neg)
• Carecer de alguna de dos enzimas requeridas
para el crecimiento en un medio de cultivo
selectivo denominado HAT
– Hipoxantina-guanosina fosforibosil-transferasa
(HGPRT) -> HGPRT-neg
– Timidina kinasa (TK) -> TK-neg

6. Medio Selectivo HAT
• Contiene hipoxantina, aminopterina y timidina
• Aminopterina actúa como inhibidor de la vía
principal de síntesis de ácidos nucleicos
• La ruta alterna utiliza la hipoxantina y la
timidina como precursores, y que requiere de
las enzimas HGPRT y TK

9. Producción de hibridomas murinos
• ↑ inmunogenicidad - ↑ expansión clonal
y ↑ probabilidad de hallar hibridomas con la
especificidad deseada
• no importa si la inmunización despertó una
respuesta contra posibles contaminantes de la
preparación de antígeno

10. Producción de hibridomas murinos
• Inmunización de ratón singénico (cepa
BALB/c) con antígeno de interés
• Se sacrifica al animal para obtener Linfocitos
esplénicos
• Mezcla de Linfocitos con células de mieloma
por Polietilénglicol (PEG) que promueve la
fusión de membranas celulares.

11. Hibridomas
Cepa BALB/c
semanas

12. • Se obtiene una cantidad de hibridomas al azar
• Se siembran las células distribuidas en placas
de 96 hoyos, en medio HAT
• Sobreviven los hibridomas y proliferan (12-
16h)
• Se prueba los sobrenadantes de los cultivos
mediante ELISA u otra técnica inmunológica
Producción de hibridomas murinos

13. • Se identifican cultivos con Ab de interés
• Se separan células en nuevo cultivo
(clonación)
• Obtención de cultivo monoclonal de
hibridoma, cuyas células se pueden conservar
congeladas en nitrógeno líquido a -196°C
Producción de hibridomas murinos

14. Separación de células
en nuevo cultivo
nitrógeno líquido a -196°C

15. Producción de AcM
• In vitro: cultivos masivos (concentraciones
desde µg/ml hasta mg/ml de medio de
cultivo)
• Material más fácilmente purificable, pero más
costoso por requerimiento de equipos,
medios y suplementos.

16. Producción de AcM
• In vivo: células del hibridoma inyectadas en
cavidad peritoneal de ratones singénicos con
respecto a la cepa que origino los LB y al mieloma
• Se produce un tumor ascítico del cuál se obtiene
grandes volúmenes con alta concentración de
AcM (mg/ml)
• Contiene proteínas contaminantes. Se requiere
de purificación.
• Se sacrifican animales.

18. Producción de AcM
• Determinación de isotipos empleando
antisueros que reconocen distintas subclases
de cadenas pesadas
• Técnicas: IDD, ELISA
• Evaluación de reacciones cruzadas,
especificidad molecular a nivel de epítopo,
probando la capacidad de unión a péptido.

19. Características AcM
• Moléculas únicas e idénticas entre sí.
• Especificidad y afinidad constante (reproducible)
• La capacidad de reconocer solo a un epítopo
disminuye la posibilidad de reacciones cruzadas con
otros Ag.
• Desventaja en precipitación: al solo reconocer un
epítopo de un Ag, no forma complejos
multimoleculares adecuados.
• Ventaja en aglutinación: reconoce un solo epítopo,
pero que está disponible repetidamente en la
superficie

20. Usos de Ab monoclonales
• Su especificidad los hace útiles
para usar como Ab primarios
en inmunoensayos.
• La especificidad también los
hace eficiente para unión a
antígeno en mezcla de
moléculas (como en
purificación por afinidad)

21. AcM Humanizados
• AcM murinos no son útiles en humanos, ya
que el sistema inmune los detecta como
extraños (HAMA: human anti-murine Ab)
• Obtención de AcM humanos: transformación
de linfocitos B mediante infección in vitro
virus Epstein-Barr, manipulación directa de
ADN, producción de Ab quiméricos y
humanizados.

22. • Epstein–Barr virus (EBV) es un virus de herpes que, in
vitro, inmortaliza eficientemente casi todoas los LB.
• Las líneas celulares linfoblastoides (LCL’s) preservan las
características iniciales de las células: producen y
secretan Ig y expresan dichas moléculas, que pueden
ser aisladas en líneas celulares que secreten Ab
específicos
• Este método permite la producción de IgM, IgG, IgA, y
IgE anticuerpos monoclonales
• Human monoclonal antibodies are promising reagents
for passive immunization.

23. Humanización de Ab
• A schematic representation of the advancement
from fully mouse antibodies, represented by red
domains, to fully human antibodies, represented
by blue domains.

24. Humanización de Ab
• Aplicación de ingeniería genética para reducir la
inmunogenicidad de Ab de ratón.
• Se produjo Ab quiméricos conteniendo dominios
constantes de Ab humanos y los dominios
variables de ratón para mantener la especificidad.
Dominio variable de ratón
Dominio constante humano
Mouse Fab
spliced to
human Fc

25. Humanización de Ab
• Posteriormente se produjo Ab humanizados
conteniendo solo los CDR de ratón (región
determinante de complementaridad), que es la
responsable de la unión a Ag
CDR de ratón
Dominio constante humano

26. Humanización a partir de quimeras de
ratón