Sesión básica sobre Proteinograma y reflejo clínico de algunas enfermedades en el espectro electroforético de las proteinas humanas en el suero.

1. Sesiones de Residentes Julio’11 PROTEINOGRAMA @dawelian martes 12 de julio de 2011 Daniel E. Pleguezuelo MIR Inmunología Servicio de Inmunología Clínica

2. Introducción características físicas: - TAMAÑO - FORMA (3D) - CARGA - PUNTO ISOELÉCTRICO El Proteinograma es el resultado de la aplicación de la técnica de electroforesis a una solución con proteínas. Electroforesis es un método para separar sustancias al aplicar un campo eléctrico dependiendo de su tamaño, forma, carga y punto isoeléctrico

3. ¿Pero cómo se mueven? VELO CID A D DE M I G R A C I Ó N Las proteínas se separan en función de las características enumeradas anteriormente, y lo hacen así porque éstas definen una diferente velocidad de migración, que depende de la intensidad del campo eléctrico y de la movilidad electroforética. Esta última es directamente proporcional a la carga iónica que presente la proteína e inversamente proporcional a las fuerzas de fricción: tamaño y viscosidad.

4. Hardware Para realizar la técnica se necesita un aparato que conste de un gel (medio en el que se moverán las proteínas), tampón o buffer (que proporciona los iones y el pH para la separacíón de las proteínas), fuente de alimentación con dos electrodos, uno positivo y otro negativo, un peine para fabricar los pocillos y estos pocillos, donde se depositarán las muestras.

5. Variantes de Electroforesis

6. Nativo En la electroforesis nativa se aplica un campo eléctrico sobre un medio con un pH definido (básico). Las proteínas, depositadas en los pocillos, se desplazarán en función de sus características físicas anteriormente enumeradas y podrán ser diferenciadas gracias a una técnica de tinción.

7. SDS-PAGE http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U SDS es un compuesto químico que destruye la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas, otorgando a las proteínas una carga negativa proporcional al tamaño de las mismas. Al aplicar el campo eléctrico, las proteínas se separarán por tamaño.

8. Electroforesis Capilar En la electroforesis capilar el medio en el que se separan las proteínas no es un gel sino un capilar artificial. A él llega la muestra mediante fuerzas hidrostáticas y se separarán también en función de sus características físicas, a lo largo del capilar.

9. Isoelectroenfoque pH del medio H+ H+ H+ H+ H+ H+ PUNTO ISOELÉCTRICO H+ Las proteínas pueden tener carga global positiva, negativa o cero. En el Isoelectroenfoque las proteínas se separan en función de su capacidad para adquirir protones, que serán incorporados a los residuos aminoacídicos. Esta capacidad para ganar protones en un medio con un gradiente de pH, hará que las proteínas se desplacen hasta un punto en el que la carga neta de cada proteína sea cero, lugar en el que detendrá su movimiento por haber alcanzado su punto de equilibrio eléctrico.

10. Isoelectroenfoque pH del medio pH < pI Proteína + pH > pI  Proteína - H+ H+ H+ H+ H+ H+ PUNTO ISOELÉCTRICO H+ ¿Hacia dónde se mueven las proteínas? Si el pH en el que se encuentra la proteína es inferior a su punto isoeléctrico, la proteína estará cargada positivamente y se desplazará perdiendo protones hasta equilibrar sus cargas y quedar fija en el punto isoeléctrico. Si el pH del medio es mayor que el que define el punto isoeléctrico, la proteína se cargará negativamente.

11. Isoelectroenfoque

12. Proteínas en el Suero Bandas del espectroelectroforético (abajo) y representación gráfica (arriba). La primera banda por la izquierda corresponde a la fracción de albúminas. La segunda a la de Alfa1, la tercera a Alfa2, la cuarta y quinta a Beta1 y Beta2 y la última por la izquierda a la fracción gamma.

13. Proteínas en el Suero

15. Pre-Albúminaanalbuminemia Deshidratación Enfermedades Hepáticas Síndrome Nefrótico Embarazo Malnutrición Hemorragias Enteropatías Malabsorcion LES Quemaduras

17. Alfa-1 Glicoproteína Ácida

18. Alfa-1 Fetoproteína

19. Alfa-1 Lipoproteína (HDL)

20. Transcortina

21. Proteína Fijadora de TiroxinaCHC Reacción de Fase Aguda Infección, Inflamación, Fiebre, Neoplasias Embarazo Déficit de Alfa-1 Antitripsina Enfermedades Hepáticas

23. Alfa-2 Macroglobulina

24. Ceruloplasmina

25. Alfa-2 Lipoproteína (VLDL)

26. PCR*RFA SdNFo Cu, RFA Reacción de Fase Aguda Infección, Inflamación, Fiebre, Neoplásicas Insuficiencia adrenal Tratamiento con esteroides DM avanzada Síndrome Nefrótico EII Malnutrición Anemia Megaloblástica Enteropatías pierde-proteínas Enfermedades Hepáticas Enfermedad de Wilson

28. Beta-2 Microglobulina

29. Beta-2 Glicoproteína

30. Fibronectina

31. C3

33. Hemopexina

34. Beta- 1Lipopróteína

35. C4↓Hb SAF SdNFo RFA RFA Hipotiroidismo CBP Ictericia Obstructiva Diabetes Mellitus Enfermedad de Cushing PAN Transferrina: Anemia Ferropénica Transferrina: Embarazo (3T) Hipocolesterolemia Enfermedades Renales (malnutrición proteica)

37. IgA s

39. IgG

40. IgEAmiloidosis Infecciones crónicas granulomatosas LLC Cirrosis Enfermedad de Hodgkin Linfomas Mieloma Múltiple Conectivopatías Macroglobulinemia de Waldenstrom Agammaglobulinemia Hipogammaglobulinemia

41. Reacción Inflamatoria

42. Reacción Inflamatoria

43. Sd. Nefrótico & Cirrosis

44. Sd. Nefrótico & Cirrosis

45. Gammapatías

46. Gammapatías

47. Déficit Alfa-1 Antitripsina

48. Enfermedad de Wilson

49. Bisalbuminemia

50. Bisalbuminemia

52. Referencias O’CONNELL T et Al. Understanding and InterpretingSerumProteinElectrophoresis. American FamilyPhysician. January 1, 2005.Volume 71, Number 1. http://www.aafp.org/afp/2005/0101/p105.html DYE ELECTROPHORESIS. PurdueUniversityVan Project. http://www.chem.purdue.edu/teacher/table_of_contents/Gel%20Electrophoresis/DYE_ELEC.5.11.96.pdf Enrique García Lara. El laboratorio en el estudio de las proteínas. Distrito Sanitario Cádiz-Lajanda. http://www.dscadizlajanda.com/images/archivos/proteinas.pdf David E. Grafin. Gel electrophoresis of proteins. Essentialcellbiology. Volume 1. Oxford UniversityPress2000.