cuantificacion de DNA

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  • Plates*Assumes Original Sample + 3 daughter samples
  • Figure 3.1 Schematic of commonly used DNA extraction processes.
  • Figure 3.3 Illustration of a human DNA quantitation result with the slot blot procedure. A serial dilution of a human DNA standard is run on either side of the slot blot membrane for comparison purposes. The quantity of each of the unknown samples is estimated by visual comparison to the calibration standards. For example, the sample indicated by the arrow is closest in appearance to the 2.5 ng standard.
  • cuantificacion de DNA

    1. 1. Extracción y Cuantificación de ADN
    2. 2. Tecnología Básica Extracción y Cuantificación Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction) Separación: Electroforesis Detección Análisis
    3. 3. Extracción de ADN: Múltiples maneras!!
    4. 4. EXTRACCION DE ADN  ORGANICA  CHELEX  PAPEL FTA  OTRAS  Extracciones basadas en estuches  QIAamp, GeneClean, etc.  Pueden depender en  Protocolos de LAB  Tipo de muestra
    5. 5. Preparación de Muestra  Extracción de ADN Orgánica  Extracción por Chelex  Extracción de ADN utilizando papel FTA  Estuches QIAamp para separar ADN  Equipo basados en robótica pueden requerir otros métodos
    6. 6. EXTRACCION ORGANICA DE ADN  PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)  PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR  CONSUME MUCHO TIEMPO  QUIMICOS PELIGROSOS  MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)
    7. 7. EXTRACCION ORGANICA DE ADN  COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO  AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K  ROMPE LAS CELULAS (SDS)  ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)  AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos  Particiona macromoléculas basedo en propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas  Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol  Alcohol Isoamyl disminuye la espuma  ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA  RECUPERACION DE ADN  Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
    8. 8. EXTRACCION POR CHELEX  1991 Laboratorios Bio-Rad  RESINA QUELANTE  REMUEVE MAGNESIO  (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)  ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA CELULA  UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)
    9. 9. EXTRACCION POR CHELEX  AÑADA MUESTRA AL TUBO  AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX  100°C PARA ROMPER CELULAS  DESTRUIR PROTEINAS  ADN ES DENATURADO A CADENAS SENCILLAS  UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR
    10. 10. EXTRACCION CON PAPEL FTA™  PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA  CONTIENE QUIMICOS  PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO  ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS  UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
    11. 11. Tecnología FTA®  Rompe cé lulas y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)  Preserva y Proteje Acidos Nucleicos -Previene Daño por radicales libres/UV -Previene Daño Enzimático -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias  Provee Seguridad al Usuario -Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos
    12. 12. Preparación de ADN Rápida y Eficiente
    13. 13. FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva 10 Platos = 240 muestras Temp de almacenaje = -200 C 240 Tarjetas = 240 muestras Temp de almacenaje = Temp ambiente Costo $2,000/congelador/año Costo $75/gabinete de archivo 240 Tubos = 240 muestras* Temp de almacenaje= -200 C Convencional versus FTA
    14. 14. Archivado a Temperatura Ambiente 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 6 Blue Blood-B-Pro 1000 2000 3000 4000 6 Green Blood-B-Pro 500 1000 1500 6 Yellow Blood-B-Pro 500 1000 1500 2000 6 Red Blood-B-Pro 200 400 600 Perfil de STR de sangre archivada en 1989 y analizada en 2003 • Muestras archivadas en ambientes diferentes, selladas en sobre de aluminio • Proceso normal de colección de muestra • 10 µL de reacciones de Profiler™ añadido a muestras, 24 ciclos
    15. 15. EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™  Sangre o saliva seca en papel FTA  Células se ROMPEN al contacto  UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al TUBO  LAVE para remover HEME y otros inhibidores de PCR  Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR
    16. 16. EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™  CUANTIFICACIÓN NO es necesaria  Cantidad de muestra consistente  Resultados consistentes  Posible AUTOMATIZACIÓN
    17. 17. ORGÁNICA Papel FTACHELEX Mancha de sangre ROTO LAVAR Múltiples veces con buffer de extracción PREPARAR PCR Reactivos de PCR SDS, DTT, EDTA y proteinase K ENCUBAR (56 o C) Phenol, chloroform, isoamyl alcohol CUANTIFICAR ADN Aplicar sangre al papel y dejar que se sequeMancha de sangre VORTEX (NO CUANTIFICACIÓN) Agua ENCUBAR (ambiente) 5% Chelex ENCUBAR (100 o C) REMOVER sobrenadante ENCUBAR (56 o C) CUANTIFICAR ADN PREPARAR PCR PREPARAR PCR Centrifugar Centrifugar Centrifugar Centrifugar REMOVER sobrenadanteTRANSFER aqueous (upper) phase to new tube CONCENTRAR muestra (Centricon/Microcon-100 or ethanol precipitation) Centrifugar TE buffer Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
    18. 18. CUANTIFICACIÓN DE ADN  ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR  MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS  DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA  MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS  ABSORBENCIA A 260 nm  TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO  Cuantificación comparada a marcador estándar
    19. 19. Cuantificación por "Slot Blot"  Procedimiento Común  Específico para primates  Ha sido modificado para utilizar quimioluminiscencia en vez de radioactivida  Puede detectar cantidades menores que nanogramos  Puede detectar ADN de cadena doble y cadena sencilla
    20. 20. CUANTIFICACIÓN DE ADN  CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT"  ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE PRIMATE  D17Z1  RADIOACTIVO  COLORIMÉTRICO  QUIMIOLUMINISCENTE
    21. 21. CUANTIFICACIÓN DE ADN  CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN  AÑADIR PRUEBA D17Z1  INTENSIDAD DE LA MUESTRA COMPARADA A ESTÁNDARES  SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50 copias de ADN genómico
    22. 22. Slot Blot Ventajas Desventajas  Puede ser sensitivo  Reemplaza radioactividad  Puede detectar cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado.  Cantidad dada es sólo de ADN humano  Consume tiempo  Labor intensiva
    23. 23. 20 ng 10 ng 5 ng 2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng20 ng 10 ng 5 ng 2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng Estándares de Calibración Estándares de Calibración Muestras Desconocidas ~2.5 ng Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
    24. 24. Fluorometría vs Espectrofotometría
    25. 25. Fluorometría *Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o PicoGreen -- aumento en emisión a 458 nm cuando enlazado a ADN de doble cadena *Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla o ARN --se enlaza al surco menor, rico en A-T *Muestra es comparada a curva estándar de ADN cuya concentración es conocida --utilize estándar con composición similar para lecturas más precisas
    26. 26. Cuantificación de ADN por espectrofotometría  Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo  Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0. Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml
    27. 27. Pureza de ADN: Proporción A260/A280 *Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.) *ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5 *Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN) --imita alta pureza y producción --aumenta el valor A260
    28. 28. PCR utilizando 'Real time' (qPCR) Continuará!!

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