Ponencia presentada en el marco de las I Jornadas Científicas del Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (8-9 noviembre, 2010. Zaragoza)

2. Investigador de la Fundación IVI, Valencia, Spain- Director Científico de iGenomix, Valencia, Spain - Profesor Asociado de la Univ. De Valencia y Pablo de Olavide de Sevilla

3. IMPLANTACIÓN EMBRIONARIA Un embrión en estadío de blastocisto Seleccionar el mejor embrión - DIÁLOGO MOLECULAR % EMBARAZO Receptividad endometrial Para conocer las bases moleculares de la infertilidad Para mejorar los ciclos de estimulación ovárica

4. INTRODUCCIÓN AL ENDOMETRIO HUMANO

5. VENTANA DE IMPLANTACIÓN CLÍNICA LH+0 14 15 16 17 18 19 20 21 LH+7 Bergh P, Navot D. Fertil Steril 1992; 58: 537-42

6. Características del endometrio receptivo Marcadoresmorfológicos MarcadoresBioquímicos Patrones de expresióngénica

7. ESTUDIOS HISTOLÓGICOS Psychoyos Ann N Y Acad Sci 86, Murphy et al Cell Biology Int 1994

8. LOS CRITERIOS DE NOYES, 1950 Noyes y cols., Fertil Steril 1950; Noyes y cols., Am J Obstet Gynecol 1975

10. Balasch J, Fabregues F et al., (1992) The usefulness of endometrial biopsy for luteal phase evaluation in infertility Hum Reprod 7:973-7.

11. American Society for Reproductive Medicine (2000) A practice committee report: optimal evaluation of the infertile female ASRM, 2000:1-6.

12. Murray MJ, Meyer WR, Zaino RJ, Lessey BA, et al., (2004) A critical analysis of the accuracy, reproducibility, and clinical utility of histology endometrial dating in fertile women. Fertil Steril 81:1333-43.

14. mRNA? DESDE EL GENOMA HASTA LA FUNCIÓN DNA – 30 K genes Proteínas? Hitos Estructura DNA 1953 CódigoGenético 1961 ProyectoGenoma 1985-2003 Nuevastecnologías Microarrays 1995 Secuenc. Masiva 2006 Procesos Biológicos Funciones Biológicas Vida/Muerte

15. EL ENFOQUE TRADICIONAL VERSUS EL ENFOQUE GENÓMICO

17. Basada en la complementariedad de los ácidosnucleicos

18. Permiteanalizarcientos de eventos en un solo experiemento

20. GENES REGULADOS DURANTE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN Results (>3.0 fc in 4 out of 5) Riesewijk et al. MolecHumanReprod 9, 253-64, 2003

21. P ri nc ip a l C o mp o n e n t A n a l ys i s L H+ 2 and L H+ 7 s amp l es ba s ed o n 2000 r and o m gene s L H+ 2 11 7 56 2000 L H+ 7 90 6 8 1500 1000 90 6 4 11 7 56 500 86 6 9 0 86 6 9 -500 92 8 6 -1000 90 6 4 90 6 8 -1500 92 8 6 -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000 PCA 1

22. GENES DE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN Horcajadas et al. MolecHumanReprod2005 Horcajadas et al., JCEM 20062003 Horcajadas et al., JCEM 2007 Horcajadas et al., JCEM 2008

23. AFFIMETRIX HG-133A >22,000 genes 50 WOMEN LH Day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 hCG Day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MICROARRAY Caucasian Fertile women with normal cycles 23–39 years body mass index:19-25 kg/m2 EXPRESIÓN GÉNICA EN CICLOS NATURALES Y ESTIMULADOS EN LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN EXPERIMENTAL DESIGN FIVE ENDOMETRIAL BYOPSIES AT EACH TIME POINT GeneSpring 7.0 GEPAS HISTOLOGICAL CONTROL: BLIND DATING BY NOYES CRITERIA

24. PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Day LH/hCG+1 Day LH+1/hCG+1

25. PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Day LH/hCG+3 Day LH+3/hCG+3

26. PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Day LH/hCG+5 Day LH+5/hCG+5

27. PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Day LH+7/hCG+7

28. PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Day LH/hCG+9 Day LH+9/hCG+9

29. PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) Natural/LH vs IVF across the WOI RECEPTIVE PRE-RECEPTIVE

30. BIOLOGICAL PROCESSES FROM DAY LH+1 TO LH+9 COMPARED TO COS CYCLES

31. 1 1 2 2 3 3 GENE CLUSTERING IN NATURAL AND COS CYCLES 34.4% WOI GENES 92%

32. BIOLOGICAL PROCESSES OF THE 203 DELAYED GENES

33. BIOLOGICAL CONECTIONS AMONG THE 203 DELAYED GENES Horcajadas et al., 2008 JCEM

34. Journal of ClinicalEndocrinology of Metabolism 2008, 93:4500-4510

36. Cómo usar esta información en la clínica?

37. Desde la básica a la clínica

38. APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE MICROARRAYS- Para la evaluación de la receptividad endometrial

39. New EnglandJournal of Medicine 2006;354:2463-72.

40. Integrando toda esta información para elaborar una herramienta molecular para el dataje endometrial INSTITUTO NACIONAL DE BIOINFORMÁTICA ERA DATOS DE EXPRESIÓN GÉNICA Endometrial Evaluation/Dating Predictor EEP or EDP BIOINFORMÁTICA APLICADA A GENÓMICA FUNCIONAL

41. 15k Endometrial ReceptivityArray (ERA) Grupo de prueba: 206 + 28 + 76: 310 genes – 17 genes = 293 genes / 738 sondas Número total de spots:15.744 spots Control Agilent: 536 spots Spots útiles: 15.208 spots 8 replicates = 738 x 8 = 5.904 spots Spots Vacíos= 9.304 8x15K

42. Endometrial ReceptivityArray (ERA) Prophet Francisco Esteban, Universidad de Jaén

43. ¿Cómo trabaja un Predictor? LH+7 LH+7 LH+2 Día 9 Sondas desconocido Sondas

44. Endometrial ReceptivityArray (ERA) Hierarchicalclustering R NR

45. Endometrial ReceptivityArray (ERA) Gene Ontology

46. Endometrial ReceptivityArray (ERA) Gene clustering

47. Endometrial ReceptivityArray (ERA) TranscriptomicSignature

48. Endometrial Receptivity Array (ERA) Comparison with Histology

49. FARMACOGENÓMICA FARMACOGENÓMICA EN CICLOS DE ESTIMULACIÓN OVÁRICA

50. FARMACOGENÓMICA Ciclos de estimulación ovárica Bajas respondedoras Altas respondedoras Normo respondedoras

51. OBJETIVO Nuestra propuesta Detectar marcadores Una herramienta predictora del tipo de respuesta frente a los ciclos de estimulación ovárica COMO?  Buscar marcadores e incluirlos en una plataforma diagnóstica

52. MUESTRAS Extracción de sangre (3ml en EDTA) Altas-respondedoras n=12 Bajas-respondedoras n=12 Normo-respondedoras n=12 CONTROLES

53. MARCADORES Búsqueda de marcadores 1) Detección alteraciones cromosómicas – Array CGH 2) Detección Polimorfismos – Array SNP 3) Detección mutaciones puntuales en receptores – Secuenciación 4) Analizar variantes de genes metabolismo fármacos - Luminex DISEÑO SONDAS PARA LUMINEX

54. SITUACIÓN ACTUAL Lista de genes con una sonda alterada en ambas comparaciones (muestra con Cy-3 y control con Cy-5 y viceversa). El color de la muestra significa: verde= cambio en un sentido; rojo= cambio en el otro sentido) Genes comunes

55. Las –ómicas en Medicina Reproductiva GENOMIC TRANSCRIPTOMIC PROTEOMIC METABOLOMIC Transcriptome Genomic Proteome Metabolite profiling Pathway identification Endometrial evaluation Embryoselection PreimplantationalGeneticDiagnose Pharmacogenomic POF, IF, RepeatedMiscarriage Endometrial Evaluation PreimplantationalGeneticDiagnose Endometrial disease Gene Expressionmarkers in blood Spermanalysisfor IVF or AI

56. C. Simón A. Pellicer

58. Thank you for your attention jhorcajadas@ivi.es jhorcajadas@igenomix.net