Este documento describe un experimento para evaluar el efecto de diferentes fitohormonas en el cultivo in vitro de explantes de fresa. Se cultivaron explantes en medios suplementados con ácido 2,4-diclorofenoxiacético, kinetina e indolbutirico más benciladenina. La suplementación permitió la formación de callos friables y el desarrollo de brotes viables para la regeneración y multiplicación del tejido vegetal. El cultivo in vitro es una alternativa para la propagación de plantas sanas de fresa y su mejoramiento genético.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA
VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO
MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL
Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B
EFECTO DE LA APLICACIÓN DE FITOHORMONAS EN EL CULTIVO
IN VITRO DE FRESA (Fragaria x ananassa var. Chandler)
Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Investigaciones Genéticas. UNET.
RESUMEN
La ciencia del cultivo de tejidos in vitro debe su origen a la investigación sobre las hormonas
que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se organizó con las
técnicas básicas de microbiología, por las cuales los microorganismos se hacen crecer en
medios estériles para su multiplicación e identificación. Desde esta perspectiva se ha
desarrollado la tecnología por la cual las plantas se pueden propagar en gran número,
haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal o explantes, sobre una fórmula precisa de
nutrientes en un recipiente estéril. A tal efecto, usando un medio de cultivo MS (Murashige
y Skoog), se evaluó el efecto de la aplicación de reguladores de crecimiento: auxinas (ácido
2,4-diclorofenoxiacético) para la inducción de callos, kinetina (KIN) para la elongación
celular, y la mezcla de IBA (ácido indolbutirico) con BA (benciladenina) para la
multiplicación vegetativa y generación de brotes, sobre el crecimiento de explantes de fresa
(Fragaria x ananassa var. Chandler). La suplementación de las diferentes hormonas en el
cultivo in vitro permitió la formación de callos friables y desarrollo de brotes viables para la
regeneración y multiplicación del tejido vegetal en estudio.
Palabras clave: Cultivo de tejidos, embriogénesis, “in vitro”, fitohormonas, fragaria sp.
INTRODUCCIÓN
El cultivo de células y tejidos vegetales se
refiere al conjunto de técnicas usadas para
crecer células, tejidos u órganos vegetales
in vitro, bajo condiciones asépticas,
controladas y libres de microorganismos
(Street, 1977; Calva & Ríos, 1999). Se
basa en el principio de totipotencia, que
indica que cualquier célula vegetal
contiene una copia íntegra del material
genético de la planta a la que pertenece sin
importar su función o posición en ella, y
por lo tanto tiene el potencial para
regenerar una nueva planta completa (Ferl
& Paul, 2000). La aplicación de los
cultivos in vitro se puede resumir en los
estudios básicos de fisiología, genética,
bioquímica y ciencias afines; la
bioconversión y producción de

2. compuestos útiles; el incremento de la
variabilidad genética; la obtención de
plantas libres de patógenos; la propagación
de plantas; y la conservación e intercambio
de germoplasma (Mroginski & Roca,
1991).
Para crecer, los explantes requieren una
variedad de nutrientes orgánicos e
inorgánicos que deben ser suministrados
por un medio nutritivo adecuado para su
desarrollo. Generalmente, las células en
crecimiento pueden fabricar sus proteínas
a partir de fuentes adecuadas de nitrógeno
y carbohidratos suministrados por el
medio de cultivo; sin embargo, existe
además una cantidad de sustancias
orgánicas adicionales que se requieren en
cantidades mínimas y que son muy activas
en el crecimiento (Krikorian, 1991), como
las hormonas reguladoras del crecimiento.
De acuerdo con Jordán & Casareto (2006)
la presencia de hormonas en diferentes
niveles en las plantas y sus células, permite
que éstas desarrollen caminos
morfogénicos alternativos muy distintos,
los cuales pueden darse todos de acuerdo
al grado de ontogenia. Lo más general es
que las células en crecimiento por acción
de varias hormonas expresen división y
elongación celular; sin embargo, y
especialmente bajo condiciones in vitro, se
ha observado que tales células inician
procesos de diferenciación bajo ciertos
niveles hormonales, por ejemplo,
generación de elementos xilemáticos. Esta
propiedad se ha usado en ciencia y
tecnología permitiendo regenerar plantas
fértiles en forma masiva in vitro a partir de
células y a la vez, lograr los avances en
ingeniería genética.
Al respecto, cultivos como la fresa
(Fragaria sp.), planta perteneciente a la
familia Rosácea, de alto valor nutritivo,
por su contenido de vitamina C, taninos,
flavonoides, antocianinas, catequina,
quercetina, kaempferol y ácidos orgánicos
(cítrico, málico, oxálico) (Hannum, 2004),
es ampliamente usada en programas de
mejoramiento genético encaminados a
obtener variedades de días cortos de porte
intermedio y elevada productividad,
resistentes a enfermedades de mayor
incidencia, con frutos de buen sabor y
aroma y de color rojo brillante (Bartual,
2000), a la vez se han aplicado diversas
técnicas in vitro como la embriogénesis
somática, el cultivo de meristemos y la
variación somaclonal que han favorecido
la obtención de plantas de mayor vigor y
número de estolones. Además, con los
avances en la biología molecular se han
implementado una serie de herramientas
que han permitido de forma rápida y
eficiente analizar la diversidad genética
existente entre los cultivares de fresa y la
caracterización de genes (Kessel, 2012).
En efecto, el objetivo de la presente
actividad de laboratorio consistió en
evaluar la acción de diversos reguladores
del crecimiento en el cultivo de tejidos in

3. vitro de explantes de fresa (Fragaria x
ananassa var. Chandler).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Vegetal
Se utilizaron explantes de fresa (Fragaria
x ananassa var. Chandler) procedentes de
cultivos y sub-cultivos de tejidos
realizados por personal del Laboratorio de
Investigaciones Genéticos de la UNET. Al
respecto, la variedad Chandler, de origen
californiano, se caracteriza por presentar
frutos de forma cónica, alargados y un
poco planos, con pulpa roja y aromática,
robusta y particularmente resistente al
transporte (Téllez & Salmerón, 2007).
En este contexto, el cultivo de fresa, a
nivel nacional, enfrenta inconvenientes a
nivel de mejoramiento convencional,
debido a la lentitud y alto costo, ya que se
requieren entre 10 a 15 años para la
creación de una nueva variedad. Aunado a
la presencia de enfermedades de tipo viral,
el uso de cultivos continuos propagados
muchas veces de plantas enfermas, y el
costo de adquirir nuevas plantas o
semillas, limitan sus niveles de
productividad. Una alternativa de solución
son las técnicas de cultivos de tejido in
vitro, la cual permite una propagación
clonal rápida de un gran número de plantas
sanas en un periodo breve de tiempo
(Valderrama et al., 2008).
Medios de Cultivo
El medio nutritivo base fue el MS
(Murashige & Skoog, 1962), Se
suplemento el MS con reguladores de
crecimientos: ácido 2,4-dicloro
fenoxiacético (2,4-D) para inducir callos,
kinetina (KIN) para la elongación celular,
y la mezcla de ácido indolbutirico (IBA) y
benciladenina (BA) para la multiplicación
vegetativa y generación de brotes. Todos
los medios fueron preparados siguiendo
las medidas de asepsia del laboratorio y
cámara de flujo laminar, controlando
contenido nutritivo y pH del medio. Una
vez preparados fueron esterilizados en
autoclave.
Proceso de siembra in vitro
El procedimiento general consistió en
inocular un medio de cultivo gelificado
(generalmente con agar, Gelrite o
Phytagel®) con un fragmento de tejido u
órgano vegetal, llamado explante,
previamente tratado para eliminar todo
organismo que se encuentre en su
superficie (desinfestación). El cultivo se
incubo bajo condiciones ambientales de
luz, temperatura y humedad controladas,
que junto con las físico-químicas y
nutricionales conducirán el desarrollo del
explante hacia la formación de una masa
celular amorfa denominada callo, o hacia
la diferenciación en un tejido organizado
que producirá órganos o embriones. Los

4. callos obtenidos mediante este
procedimiento pueden subcultivarse para
su mantenimiento y propagación o inducir
su diferenciación para formar órganos
(organogénesis), embriones
(embriogénesis) o pasarse a un medio de
cultivo líquido para obtener células y
pequeños agregados en suspensión (Calva
& Pérez, 2005).
Se tomaron explantes de fresa (Fragaria
sp.) var Chandler sub-cultivados en el
Laboratorio de Investigaciones Genéticas
de la UNET, los cuales fueron sembrados
(23/02/2016) en medio de cultivo básico
MS suplementados con 2,4-D, KIN, y IBA
+ BA. Se realizaron cuatro tratamientos
con tres repeticiones. (1) MS, (2) MS +
2,4-D, (3) MS + KIN, y (4) MS + IBA +
BA (Fig. Nº 1). Los cultivos se
mantuvieron bajo condiciones ambientales
controladas: 25-28 ºC, pH entre 5,2 y 6,5,
y radiación promedio a 12.000 lux.
Fig. Nº 1. Siembra de explantes de fresa
(Fragaria sp.) var Chandler.
En relación con la dosificación de los
reguladores de crecimiento, estudios
realizados por Matos & Sánchez (2011),
para la inducción de callos a partir de hojas
de plantas silvestres de A. vera, se
añadieron al medio de cultivo MS
diferentes combinaciones de auxinas
(ANA y AIA) 0,1; 0,5; 1 y 2 mgL-1
, y
citoquininas (BA y KIN) 0,1; 0,5; 1; 2; 3 y
5 mgL-1
. También se probaron las auxinas
y las citoquininas solas en concentraciones
de 0,1; 0,5; 1; 2; 3 y 5 mgL-1
. Como
control, se sembraron explantes de hojas
en medio de MS sin hormonas. La
formación de callos resulto variable
dependiendo de la concentración y tipo de
hormona. En otras experiencias utilizaron
la combinación de 2,4-D (1,0 mg/l), BAP
(0,5 mg/l) y 50% prolina obteniendo altos
porcentajes de cultivos con embriones
somáticos (Valderrama et al., 2008).
Según Calva & Pérez (2005), las plantas
jóvenes o en desarrollo con tejidos
meristemáticos y crecimiento vegetativo
vigoroso son la mejor fuente de explantes.
Aunque en una misma planta se pueden
encontrar tejidos de crecimiento juvenil
como adulto, los primeros se caracterizan
por ser activos y la ausencia de estructuras
reproductoras. Además, las plantas adultas
pueden haber acumulado mayor cantidad
de microorganismos en sus tejidos y
contener menos células meristemáticas,
necesarias para establecer cultivos de
tejidos.

5. El éxito de la inducción y establecimiento
de cultivos de callos, y en consecuencia la
subsiguiente regeneración de tejidos y
plantas, son función de la calidad del
explante usado, que a su vez depende de la
planta madre o del tejido del que se inició
el cultivo. De manera tal, para el inicio de
los cultivos se prefieren los tejidos que
contengan células meristemáticas, las
cuales se diferencian rápidamente en
respuesta a estímulos organogenéticos
como variación en el tipo y concentración
de reguladores del crecimiento vegetal
(Doerner, 2000).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Al suplementar un medio de cultivo base
(MS) con auxinas y citoquininas, solas o
en combinación, los resultados en cuanto a
la inducción de callo y regeneración de
brotes en los explantes de Fragaria x
ananassa var. Chandler, fueron variables.
La observación se realizó a los 54 días de
iniciado el proceso de cultivo in vitro. Las
muestras fueron mantenidas en cámara de
incubación durante el transcurso del
ensayo. Cuando los explantes de hojas se
cultivaron en medio MS sin hormonas
(control), la formación de callos fue nula
(Fig. Nº 2.1), los explantes se mantuvieron
en el medio sin desarrollar ningún tipo de
estructura especial, ya sea callos,
generación de brotes o elongación celular,
esto debido a que, por sus características,
contenido de macro y micronutrientes
esenciales para la supervivencia de la
planta, y nutrientes (hidratos de carbono,
vitaminas), el medio de cultivo MS
constituye solo un medio de
mantenimiento.
Fig. Nº 2. (1) Medio de cultivo base (MS), (2)
Medio de cultivo MS suplementado con ácido
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), (3) MS +
kinetina (KIN), (4) MS + ácido indolbutirico
(IBA) y benciladenina (BA).
En cuanto a la reacción del explante al
entrar en contacto con el 2,4-D (Fig. Nº
2.2), se observa que las células comienzan
a dividirse muy rápido y aumentan su
volumen desorganizadamente. Con el

6. tiempo, el proceso va tomando cuerpo
hasta convertirse en callo. La característica
del callo está en función de la viabilidad de
los brotes que puede generar
posteriormente para la inducción y
generación de brotes múltiples. En la
inducción de callos, se presentan dos tipos:
compacto y friable. Un callo compacto es
de preferencia color verde, café, cremoso,
nodular, firme y organizado, con tendencia
a convertirse en un callo no embriogénico.
En cambio, el callo blanco, de tipo friable
y blando, tiene todas las características de
un callo embriogénico, con alta capacidad
de regeneración por un largo periodo de
tiempo y fuerte tendencia a la
diferenciación (Valderrama et al., 2008).
El callo observado en el presente ensayo
presenta coloración amarillenta opaca,
característico de la presencia de
antocianinas, de apariencia compacta,
piloso y con pequeños brotes débiles, en
general apariencia inferior, posiblemente
debido al estrés ocasionado por las
condiciones ambientales del medio y al
tiempo del ensayo.
La suplementación de Kinetina (KIN) al
medio MS (Fig. Nº 2.3), se muestra
promisoria para el proceso de elongación
celular. La cantidad de citoquinina
endógena en los meristemos y ápices es
baja, debido a que el principal sitio de
síntesis son las raíces, por lo que en estos
casos la adición exógena de citoquinina en
los medios de cultivo es una práctica
generalizada (Vilchez et al., 2009). El
medio de cultivo suplementado con
kinetina (KIN) generó una amplia
inducción de yemas axilares, provocando
la elongación de los explantes de fresa.
La interacción entre IBA + BA (Fig. Nº
2.4), permitió la inducción de callo y la
presencia de brotes generados del callo
inicial. Estos brotes pudiesen ser viables
para ser sub-cultivados para la
propagación de la variedad de fresa.
Las citoquininas, junto a las auxinas,
promueven la producción de tejidos no
organizados denominados callos, de los
cuales es también posible inducir la
formación de brotes y/o raíces, como
también de embriones somáticos
conducentes a plantas. Gran parte de las
respuestas de totipotencia celular, de
morfogénesis in vitro y de regeneración de
plantas, ocurre en presencia de niveles
apropiados de citoquininas vs. auxinas
(Jordán & Casareto, 2006)
Específicamente, la acción de las auxinas
depende de su concentración y de sus
interacciones con otro regulador para la
formación de los embriones, y esta
relación debe ser igual o mayor en algunas
de ellas, también se deben tener en cuenta
el estado fisiológico del tallo primario. Las
auxinas son una de las sustancias más
usadas como agente mediador en la
transición de las células embriogénicas
(Valderrama et al., 2008).

7. Experiencias de cultivos in vitro han
permitido determinar que la variación
somaclonal ha sido una de las técnicas
biotecnológicas que se ha empleado para
el mejoramiento genético de variedades en
diversos cultivos, debido a que constituye
una forma rápida de generar variabilidad
genética, particularmente para cultivos con
base genética estrecha y que son difíciles
de mejorar a través de técnicas
tradicionales. Igualmente es exitosa para
eliminar uno o pocos defectos en
cultivares bien adaptados y puede
utilizarse para mejorar especies de
propagación sexual y vegetativa. Sobre la
fresa se han reportado diferentes estudios
donde a partir de la inducción de callos y
la regeneración se han obtenido variantes
somaclonales (Saavedra, 2005).
CONCLUSIONES
En la presente investigación se evaluó el
efecto de varios reguladores del
crecimiento vegetal en la respuesta in
vitro de explantes de fresa. El medio MS
suplementado con 2,4-D fue el método
más eficiente en la formación y el
desarrollo de callos, y las combinaciones
de IBA+BA, permitieron obtener un alto
porcentaje de inducción vegetativa y
regeneración de múltiples brotes.
La adición de kinetina (KIN) como
suplemento al medio MS afecto la
elongación celular descontrolada de los
explantes de fresa.
Es preciso definir la dosificación
adecuada de cada regulador del
crecimiento, ya que la cantidad aplicada
va en función de la inducción o inhibición
del crecimiento celular.
Las técnicas in vitro constituyen una
alternativa eficiente para la adecuación de
nuevas tecnologías en la propagación del
cultivo de fresa (Fragaria x ananassa var.
Chandler).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bartual, R.; Marsal, J. I. y López-Aranda, J. M.
Andana y Carisma dos nuevas variedades
de fresa que ofrecen una gran capacidad
productiva. Vida Rural, 2000, no. 105, 54-
57.
Calva C. G., Ríos L. E. (1999). Cultivo de callos y
acumulación de metabolitos secundarios.
En: Rodríguez V. R., Calva C. G., Ramos
R. E. G., Salazar M. A. (Eds.) Aspectos
aplicados de la biotecnología. pp 267-301.
Calva-Calva, G., Pérez, J. (2005) Cultivo de células
y tejidos vegetales: fuente de alimentos
para el fututo. Revista Digital
Universitaria. 6(11). 1-16.
Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L. (2004).
Control de la oxidación y la
contaminación en el cultivo in vitro de
fresa (Fragaria X ananassa Duch.).
Revista Científica UDO Agrícola, 4(1),
21-26.
Doerner, P. (2000) Cell división regulation: En:
Calva-Calva, G., Pérez, J. (2005) Cultivo
de células y tejidos vegetales: fuente de

8. alimentos para el fututo. Revista Digital
Universitaria. 6(11). 1-16.
Ferl, R., Paul A. L. (2000). Genome organization
and expression. En: Buchanan B.,
Gruissem W., Jones R. (eds.)
Biochemistry and Molecular Biology of
Plants. USA: American Society of Plant
Physiologists, pp. 312-357.
Hannum, S. M. Potential impact of strawberries on
human health: A review of the science.
Critical Reviews in Food Science and
Nutrition, 2004, vol. 44, p. 1-17.
Jordán, M., & Casaretto, J. (2006). Hormonas y
Reguladores del Crecimiento: Auxinas,
Giberelinas y Citocininas. En: Fisiología
Vegetal. FA Squeo, L. Cardemil. La
Serena, Chile. Ediciones Universidad de
La Serena. Cap, 15.
Kessel Domini, A. (2012). Mejora genética de la
fresa (Fragaria ananassa Duch.), a través
de métodos biotecnológicos. Cultivos
Tropicales, 33(3), 34-41.
Krikorian, A. D. (1991). Medios de cultivo:
generalidades, composición y
preparación. Cultivo de tejidos en la
agricultura: fundamentos y aplicaciones.
Cali: CIAT, 41-77.
Matos A., A. Sánchez, A. (2011) Evaluación de
reguladores de crecimiento para la
inducción de callo en Aloe vera L.
Multiciencias, Vol. Nº 11. Pp. 7-14.
Universidad del Zulia. Venezuela.
Mroginski, L. A., & Roca, W. M. (1991).
Establecimiento de cultivos de tejidos
vegetales in vitro. Cultivo de tejidos en la
agricultura: Fundamentos y Aplicaciones.
En: Control de la oxidación y la
contaminación en el cultivo in vitro de
fresa (Fragaria x ananassa Duch.).
Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L.
(2004).
Saavedra, A. Producción de plántulas in vitro de
frutillas (Fragaria chiloensis D.) libre de
patógenos. Andenes, 2005. Vol. 3 Nº 5.
Pp. 16-17. En: Mejora genética de la fresa
(Fragaria ananassa Duch.), a través de
métodos biotecnológicos. Kessel Domini,
A. (2012).
Street H. E. (1977). Cell (suspension) cultures
techniques. En: Street H. E. (Ed). Plant
tissue and cell culture. Blackwell
Scientific Publishing., Oxford., England.
pp. 61-102.
Téllez L., F., Salmerón D., L. (2007) Efecto de
cuatro niveles de fertilización orgánica
sobre tres variedades de fresa (Fragaria
spp.) en las Sabanas, Madríz. (Tesis de
Grado) Universidad Nacional Agraria.
Facultad de Agronomía. Escuela de
Producción Vegetal. Managua,
Nicaragua.
Valderrama-Alfaro, Shirley, Chico-Ruiz, Julio,
Tejada-Castillo, Jésica y Vega-
Anhuamán, Amelia (2008) Regeneración
de plántulas, vía embriogénesis somática,
a partir de hojas de fresa, Fragaria
virginiana, utilizando ANA y BAP.
REBIOL. Vol. 28, Nº 2.
Vilchez, J., Rivas, Y., Albany, N., Molina, M., &
Martínez, L. (2009). Efecto de la N6
-
bencilaminopurina sobre la multiplicación
in vitro de ocumo criollo (Xanthosoma
sagittifolium L. Schott). Revista de la
Facultad de Agronomía, 26(2).
Villalobos V.M. y M.G. Pérez. 1979. Alta
producción de plantas de fresa libres de
virus a partir del cultivo de meristemos.
Proc. Tropical Región ASHS 23:70-72.
En: Control de la oxidación y la
contaminación en el cultivo in vitro de
fresa (Fragaria x ananassa Duch.).
Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L.
(2004).
Villegas, M, A. 1990. Micropropagación de fresa
(Fragaria x ananassa Duch.) En: Control
de la oxidación y la contaminación en el
cultivo in vitro de fresa (Fragaria x
ananassa Duch.). Cuevas, M. C. S., &
Salaverría, J. L. (2004).