1. MÉTODOS DE
ESTUDIO EN
HISTOLOGÍA
M.C.D. Ma. De Lourdes Urquizo Ruvalcaba
Esp. Patología y Medicina Bucal

2. MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA
 HISTOLOGÍA
 Estudia la microanatomía de las células, los tejidos y
los órganos y correlaciona su función.
 HISTOTECNOLOGÍA
 Conjunto de técnicas que se llevan acabo para la
preservación y preparación de los tejidos y células,
para su estudio con microscopio de luz y sus
variantes

3. MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA
OBJETIVOS DE LA HISTOTECNOLOGÍA
 Preservación optima y funcional de los diferentes
materiales tisularesy celulares que llegan al laboratorio.
 Conocer los principios de las técnicas rutinarias y
especiales, así como sus indicaciones precisas para el
estudio de los tejidos

4. TÉCNICA HISTOLÓGICA
 Comprende la preparación de tejidos para su
estudio microscópico.
 Se logra sometiéndolos a una serie de procesos:
 Obtención del tejido a estudiar
 Fijación
 Deshidratación
 Aclaramiento
 Inclusión
 Corte
 Montaje
 Observación (Diagnóstico)

5. TÉCNICA HISTOLÓGICA
OBTENCIÓN DEL TEJIDO A ESTUDIAR
 BIOPSIAS
 Incisional
 Excisional
 NECROPSIA O AUTOPSIA
 CITOLOGÍA EXFOLIATIVA
 FROTIS

6. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJACIÓN
 Se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas
que tienen varias finalidades:
 Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc.
 Conserva la estructura morfológica y química de las células y
tejidos al estado vivo (citoarquitectura y ultraestructura)
 Aumenta la dureza del tejido para facilitar la preparación de
finas películas de éste.
 Y permite realizar, posteriormente, los procedimientos de
coloración o de identificación que facilitan el completo
conocimiento de su constitución íntima

7. TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN
FIJADOR
 Actuar con rapidez, matando y fijando a las células
antes de que aparezcan autólisis, desintegración,
etc.)
 Poseer alto poder de penetración para asegurar la
fijación correcta hasta en las capas profundas.
 Conservar, en lo posible, los detalles estructurales
que presentaban in vivo

8. TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN
FIJADOR
 Permitir o favorecer el empleo de los
procedimientos necesarios para su observación
ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.)
 No provocar o impedir la producción de estructuras
artificiales
 No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos
friables o quebradizos.

9. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
¿Cómo actúan los fijadores?
 Varía con la composición o naturaleza
 Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas
(alcohol, ácido pícrico, yodo, calor)
 Formando combinaciones químicas con las sustancias
orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose
en contacto con las mismas y originando un precipitado
sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio,
cloruro de oro).
 La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes,
favorece la coloración ulterior de los tejidos.

10. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
 Son los más utilizados
 Pueden ser:
 Fijadores simples
 constituidos por una sola sustancia química
 Fijadores compuestos
 cuando varias fijadores simples intervienen en su
constitución
 racionalmente elegidos con el fin de completar la
acción de cada uno de ellos o atenuar sus
efectos

11. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES SIMPLES
 Form al 10%
ol
 e s e l m á s us a d o .
 Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando
enlaces transversales y conservando las estructuras de la
célula.
 Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se
disponga de un fijador especial, principalmente cuando se
trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos
topográficos.
 Alcohol etílico absoluto o de 96%
 Se usa generalmente en microquímica.
 Preserva el glucógeno.
 Causa distorsión del detalle nuclear y comprime el
citoplasma.

12. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES SIMPLES
 Alcohol metílico.
 Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de
punción, etc.)
 Ácido ósm al 1 ó 2%
ico
 Es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien
estructuras celulares.

13. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES SIMPLES
 Bicrom de potasio al 3-5%.
ato
 Fija el citoplasma y no se precipita.
 Nunca se usa solo.
 Después de la fijación loes especímenes deben ser
lavados exhaustivamente para remover el oxido
que se forma

14. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES COMPUESTOS
 Líquido de F ing, m e z c la c ro m o -o s m io -
lem
a c é tic a .
 Líquido de Zenker, m e z c la bic ro m a to -s ublim a d o -
a c é tic a .
 Líquido de H elly, m e z c la Ze nke r-fo rm o l.
 Líquido de B ouin, m e z c la p ic ro -fo rm o s -a c é tic a .
 Liquido de Duboscq-B rasil, o Bo uina lc o hó lic o

15. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES FÍSICOS
 Desecación.
 Calor seco.
 Coagulación de las proteínas
 No es buena ya que las células se destruyen.
 Calor húmedo.
 Frío y Congelación .
 Se congela el tejido con dióxido de carbono o N
liquido
 Es mejor que el calor pero se pueden formar cristales.

16. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
I. FIJACIÓN
 Fijación en formol al 10% (1 parte
de formol y 9 partes de agua
destilada) por lo menos durante 6
hs.
II. DESCRIPCIÓN
MACROSCÓPICA Y CORTE
 Se describe forma, color, textura,
superficie, consistencia al corte y se
mide.
 Se le da el tamaño deseado a la
pieza
 Enjuaga durante 15 min.

17. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
III. DESHIDRATACIÓN
 Debido a que una gran parte del tejido está constituida por
agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de
menor a mayor de agente deshidratante.
 Se debe deshidratar el tejido, ya que la parafina nos es
hidrosoluble
 Alcohol 70º, 1h30'.
 Alcohol 96º, 1h30'.
 Alcohol 100º (l), 1h30'.
 Alcohol 100º (ll), 1h30'.
 Toluol O Xilol , entre 1h30' y 3hs. (Aclaramiento)
 NOTA: si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se
deformaría.

18. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
ACLARAMIENTO
 Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una
sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el
medio de inclusión (PARAFINA) a utilizar.
 Se sustituye el alcohol por un líquido intermediario
normalmente el hidrocarburo bencénico (xilol, benceno,
toluol).
 Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o
claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de
refracción.
 Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y
por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los
lípidos de la célula.

19. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
IV. INCLUSIÓN
 A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos
para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser
incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme.
 gelatina y parafina.
 El objeto de la inclusión es:
 Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la
matriz extracelular.
 Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y
corte.
 La parafina penetra en los vasos, en los espacios
intercelulares y en el interior de las células embebiendo el
tejido y haciendo más fácil la obtención de cortes en el
microtomo.

20. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
IV. INCLUSIÓN
 Infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en
estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento
y penetra en el tejido.
1.Secado de la muestra con gasa.
2) Parafina 56º (l), 1h30'.
3) Parafina 56º (ll), 1h30'.
4) Formación de la barra.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco
NOTA: Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios
anteriormente ocupados por el son ahora ocupados por la
parafina

21. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
V. CORTE
 El taco ahora se puede cortar en secciones lo
suficientemente delgadas como para permitir el paso de
la luz.
 La mayor parte de los preparados para microscopia
óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros (5μ)
 MICROTOMO.

22. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE
 Los cortes todavía no son aptos para su examen con el
microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados
en parafina y carecen de color.
 Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se
les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la
cual actúa como adhesivo.
 La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo
se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola
pasar por una serie de graduaciones decrecientes de
alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% y agua.

23. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE
 Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO.
 Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y
la EOSINA.
 Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera
que pueda fijarse de modo permanente el
CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el
MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de
Canadá o similar).

24. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE
 1.Xilol o toluol(I), 15' en estufa.
 2. Xilol o toluol(II), 2'.
 3. Alcohol 100º, 30".
 4. Alcohol 96º, 30".
 5. Alcohol 70º, 30".
 6. Alcohol 50º, 30".
 7.Agua destilada, 30".
 8. Hematoxilina, 1´30".
 9. Agua corriente, 2´.
 10. Alcohol 50º, 15".
 11. Eosina, 30".
 12. Alcohol 96º, 10".
 13. Alcohol 100º, 10".
 14. Xilol, 1´ por lo menos.
 15. Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.

25. VI. COLORACIÓN Y MONTAJE
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:
 Colorantes que diferencian los componentes
ácidos y básicos de la célula.
 Colorantes especializados que distinguen los
componentes fibrosos de la matriz
extracelular.
 Sales metálicas que se precipitan en los
tejidos y forman depósitos de metales con
ellos

27. HEMATOXILINA Y EOSINA

28. Tinción PAS
(ácido peryódico-reactivo de Schiff)
 Es uno de los métodos químicos más empleados en histología.
 Tiñe carbohidratos y macromoléculas ricas en carbohidratos.
 Se usa para detectar :
 glucógeno en las células
 Moco en diversos tipos celulares
 Membrana basal subyacente a los epitelios
 Fibras reticulares del tejido conectivo
 Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos
adyacentes, cada uno con un grupo hidroxilo
 El ac, peryódico rompe la unión entre estos átomos de carbono
adyacentes y forma grupos aldehído.
 Estos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un
color púrpura intenso (rojo luminoso)

29. Tinción PAS
(ácido peryódico-reactivo de Schiff)

30. Tinción PAS
(ácido peryódico-reactivo de Schiff)

31. Tricromico de Masson
 Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y
elásticas. Se observan tres colores distintos:
 Núcleos: Negro
 Músculo, citoplasma y queratina: rojo
 Colágeno: azul o verde

32. COLORACION DE WRIGHT

33. TEJIDO CONECTIVO LÍQUIDO: SANGRE

34. NEGRO SUDÁN
Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los
TRIGLICÉRIDOS, como por ejemplo:
 Rojo de sudán o sudán III, en la coloración de células
adiposas.
 El negro de sudán o sudán IV, se emplea en la
coloración de las vainas mielínicas de las fibras
nerviosas compuestas por lipoproteínas.

35. TINCION ARGÉNTICA

36. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
INMUNICITOQUÍMICA

37. INMUNICITOQUÍMICA
DIRECTA

38. INMUNICITOQUÍMICA
INDIRECTA

39. AUTORRADIOGRAFIA

40. CRIOFRACTURA

41. CRIOFRACTURA

42. TÉCNICA HISTOLÓGICA
VII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)

43. TÉCNICA HISTOLÓGICA
VII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)

44. TÉCNICA HISTOLÓGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VII. OBSERVACIÓN (DIAGNÓSTICO)
 MICROSCOPIO