Pruebas diagnosticas de laboratorio (Bacterias)

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MANUAL DE PRUEBAS
DIAGNOSTICAS
ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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MANUAL DE PRUEBAS DIAGNOSTICAS
ENFERMEDADES INFECIOSAS
DOCENTE:
Dra. Nineth Mendoza Rocha
POR:
Elberth Alberto Mora Ruiz
Iris Elizabeth Vaquedano Rodríguez
José Carlos Pérez Alfaro
MARZO 2019

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INDICE
Contenido
CONTENIDO.............................................................................................................................4
MEDIOS DE CULTIVO........................................................................................................4
Introducción .......................................................................................................................4
Características físicas de los medios de cultivo ................................................................5
Clasificación de los Medios de Cultivo..............................................................................5
Agar BHI (Infusión Cerebro-Corazón) ............................................................................7
Agar Campy con Sangre....................................................................................................8
Agar Chocolate...................................................................................................................8
Agar McConkey .................................................................................................................9
Agar SS ...............................................................................................................................9
Practica en el laboratorio.................................................................................................10
TINCIÓN..............................................................................................................................12
TINCIÓN DE GRAM ......................................................................................................12
PRUEBA DEHIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) AL 3%..........................................18
TINCIÓN PARA BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE (BAAR) ..........18
TINCIÓN PARA ESPORAS ...........................................................................................21
SEROLOGIA PARA DETECTAR ANTIGENO ..............................................................24
Prueba de Aglutinación....................................................................................................24
ELISA................................................................................................................................25
PRUEBA DE INMUNOFLORESCENCIA....................................................................27
DIAGNOSTICO MOLECULAR........................................................................................29
Introducción .....................................................................................................................29
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).................................................................30
PCR en tiempo real ..........................................................................................................32
GLOSARIO..............................................................................................................................34
REFERENCIAS.......................................................................................................................36

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CONTENIDO
MEDIOS DE CULTIVO
Introducción
Para realizar el estudio de los microorganismos es necesario recuperarlos del habitad
natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que
proporcionen sus requerimientos nutricionales, a este procedimiento se conoce como
cultivo “in vitro”. La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción
compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos en la cual intervienen
factores físicos como la temperatura, el pH, el factor redox.
Para su crecimiento todos los microorganismos requieren agua, además deben estar
presentes en forma utilizable el carbono, oxígeno, nitrógeno, hidrógeno, calcio, fósforo y
el hierro, muchos microorganismos dependen además de oligoelementos como el
magnesio, molibdeno, zinc, cobre. Los microorganismos exigentes tienen necesidad
además de factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas u otras
sustancias que no pueden sintetizar ellos mismos.
El carbono se necesita en la mayor parte de las veces en forma de compuestos
orgánicos, que luego sirven como fuente de energía, el oxígeno se toma principalmente
de la atmósfera, las necesidades de hidrógeno se cubren con compuestos orgánicos y, en
casos particulares, también a partir de compuestos inorgánicos. El nitrógeno proviene de
sales en forma de nitratos, nitritos o compuestos amónicos, o de componentes más
complejos como aminoácidos, peptonas o proteínas. Los otros elementos se toman
principalmente de sales.
Los medios de cultivo sintéticos están compuestos de una serie de substancias
químicas definidas exactamente, los medios de cultivo complejos contienen diferentes
extractos, hidrolizados u otros aditivos.

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Características físicas de los medios de cultivo
Medios líquidos
Son medios que no contienen agar (agente solidificante), son envasados en tubos,
botellas y matraces.
Medios semisólidos
Son medios que contienen 0.5 a 0.75% de agar. Son envasados en tubo y no se
solidifican totalmente a la temperatura ambiente.
Medios sólidos
Existen dos tipos, los que contienen 1.5% de agar y los que contienen 3 a 7% de agar
llamados medios duros. Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos.
El agar-agar es un extracto seco gelificante, obtenido de algunas especies de algas
marinas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y
Adanthopeltis. En el medio de cultivo pueden estar presentes colorantes e indicadores
cuyo cambio de color será característico para un determinado intervalo de pH.
Clasificación de los Medios de Cultivo
Como es lógico suponer no todos los medios de cultivo son utilizados para el
aislamiento de todas las cepas bacterianas, utilizados para el aislamiento de todas las
cepas bacterianas, en ocasiones no solo son aptos para el aislamiento de microorganismos
en general, sino que además poseen la capacidad de inhibir a algunos y favorecer el
desarrollo de otros.
Basados en el propósito para el cual son fabricados los medios de cultivo se pueden
clasificar de la siguiente manera:

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Medios de cultivo básicos
Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para promover
el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Reciben también el
nombre de medios generales y pueden ser utilizados en análisis cuantitativos, para
muestreo de medio ambiente, superficies y para conservar cepas. Ejemplos: Caldo
nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar nutritivo. Agar soya tripticasa.
Medios enriquecidos
Son medios que se suplen con factores de crecimiento para el desarrollo de bacterias
y hongos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios generalmente
contienen uno o más de los siguientes ingredientes: sangre, suero, líquido ascítico, huevo,
carne, vitaminas y aminoácidos específicos, entre otros. Ejemplos: Agar sangre, agar
Sabouraud con ácido nicotínico, agar Lowestein-Jensen, caldo infusión cerebro corazón.
Medios de enriquecimiento
Son muy utilizados, sobre todo en cultivos entéricos, estos medios se utilizan para
aumentar la propagación de ciertos organismos sin favorecer a otros. Son muy eficaces
en el aislamiento de Salmonella a partir de heces. Ejemplos: Caldo selenito de sodio,
caldo selenito y cistina, caldo tetrationato, caldo-sal-colistina, agar sangre + levadura de
cerveza, agar yema de huevo con leche.
Medios selectivos
Son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas del cuerpo
que poseen una flora normal abundante (faringe, boca, piel nariz, vagina, etc.). En estos
se incorporan substancias inhibidoras de la propagación de un grupo de bacterias, pero
permiten en cambio el crecimiento de otros grupos. Así para el cultivo entérico, los
medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben
los organismos Gram positivos y permiten la propagación de los bacilos entéricos Gram

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negativos. Ejemplos: Agar verde brillante (VB), agar Salmonella Shigella (SS), que son
medios selectivos para Salmonella, agar Mac Conkey (Mac C), agar ENDO y agar Eosina
azul de metileno (EMB), que son selectivos para enterobacterias, agar manitol sal (MSA),
agar Staphylococcus 110 y Chapman Stone, selectivos para Staphylococcus.
Medios diferenciales
Este tipo de medios, debido a los componentes químicos e indicadores que contienen,
permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas, por el
aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también
diferenciales. Ejemplos: Agar verde brillante, agar Salmonella-Shigella, agar Mac
Conkey, agar ENDO, agar eosina azul de metileno. Estos permiten diferenciar
enterobacterias fermentadoras de la lactosa (coliformes) de las no fermentadoras de la
lactosa (no coliformes).
Medios para el estudio de carbohidratos
En los medios de cultivo, los carbohidratos y glucósidos son muy utilizados como
fuente de energía por las bacterias, y particularmente para diferenciar géneros e identificar
especies se utiliza generalmente agua peptonada como base para el estudio de los
azúcares, las soluciones de carbohidratos empleados para estas pruebas, deben
esterilizarse por filtración, ya que al calentarse los azúcares sufren varios fenómenos,
como la formación de productos de oxidación y reaccionar con algunos otros
componentes de los medios de cultivo como aminoácidos. Ejemplos: Medio basal OF de
Hugh y Leifson, medio para MR-VP y todos aquellos en los cuales se pruebe algún azúcar
en particular (agua peptonada + glucosa, manitol, sucrosa, sorbitol, galactosa, etc.).
Agar BHI (Infusión Cerebro-Corazón)
Es un medio de uso general adecuado para el cultivo de una amplia variedad de tipos
de organismos, incluidos las bacterias, levaduras y hongos filamentosos, a partir de

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muestras clínicas. Esta infusión es una formula muy rica que puede emplearse, ya sea
como caldo o como medio sólido, con sangre adicional o sin esta. Los componentes claves
incluyen infusión de distintos tejidos animales con el agregado de peptona, tampón
fosfato y una pequeña concentración de glucosa que proporciona una fuente de energía
fácilmente accesible a los microorganismos.
Se emplean generalmente como medio para hemocultivos y como medio base para
muchas pruebas metabólicas, en especial para la identificación de Streptococcos.
Agar Campy con Sangre
Es un medio selectivo para el aislamiento primario de
Campylobacter jejuni y otras especies de Campylobacter
resistentes a la cefalotina, a partir de muestras de heces.
Agar Chocolate
Este medio usa la misma base
que el agar sangre. En un principio,
los eritrocitos se adicionaban a
lavase fundida y luego se eleva la
temperatura (alrededor de 85 °C)
para lisar prácticamente las células,
lo que otorgaba el color de pardo-
chocolate. Actualmente, la hemoglobina y otros nutrientes presentes en los lisados de los

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glóbulos rojos, como hemina (factor X) y coenzima NAD (factor V), se añaden como
suplementos a un agar base muy rico.
Agar McConkey
Es un medio selectivo y diferencial utilizado para la
recuperación de enterobacterias y bacilos gran negativos
entéricos relacionados. Contiene sales biliares y cristal
violeta que inhibe el desarrollo de bacterias gran positivas
y gram negativas exigentes. La lactosa es la única fuente
de carbono y el indicador es el rojo neutro. Ejem: Shigella.
Agar SS
Este medio lleva sales biliares, citrato sódico y férrico, tiosulfato y el colorante verde
brillante. El carácter diferencial se basa en la fermentación de la lactosa. Incorpora rojo
neutro. Las colonias lactosas positivas son de color rojo, mientras que las lactosas
negativas son transparentes (Shigella). Las colonias de Salmonella son transparentes con
el centro negro.

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Practica en el laboratorio
Materiales
Matraces Erlenmeyer
Mechero
Espátulas
Cajas de Petri
Autoclave
Balanza granataria
Papel aluminio
Tubos de ensaye
Procedimiento
Los fundamentos de preparación, distribución y esterilización de los medios de cultivo
son esencialmente iguales, utilizando las formas deshidratadas o bien añadiendo los
distintos ingredientes por separado.
Casi todos los medios de cultivo utilizables se encuentran en el comercio en forma
deshidratada y se determina simplemente la cantidad necesaria de polvo, según las
instrucciones y se añade al agua destilada necesaria. Es importante utilizar un frasco o
matraz Erlenmeyer lo suficientemente grande para que se pueda remover o agitar bien
para disolver el medio.
Una vez preparado el medio, se distribuyen recipientes adecuados mientras están
todavía calientes, los métodos de distribución de los medios disueltos en cajas de Petri,
tubos o frascos, dependen del tipo de medio y de la finalidad de su empleo.

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Pesar la cantidad requerida del medio deshidratado
utilizando un papel o papel aluminio, evitando con éste
pérdidas del polvo sobre la balanza.
El medio se añade a una pequeña cantidad de agua
destilada o desmineralizada, fría y se distribuye
uniformemente por agitación, enseguida añadir la
cantidad restante de agua y se homogeniza.
Se deja reposar la solución durante 10 a 15 minutos a
temperatura ambiente, para que el agar pueda hincharse.
Para disolver completamente los medios deben calentarse
a más de 95ºC.
Los medios de cultivo clarificados, se esterilizan en
autoclave utilizando la forma convencional de 121ºC por
15´ y a 15 lb de presión, estas constantes van a depender
del tipo de medio a esterilizar.

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El medio agarificado, todavía líquido se vierte en las
cajas de Petri. El volumen es variable y depende del
tamaño de las cajas; se recomienda 15 a 20 ml para las
cajas de 31/2 plg. Y de 20 a 35 ml para las cajas de 4 plg.
Si aparecen burbujas de aire en las cajas, se eliminan
pasando la llama del mechero de Bunsen por la superficie.
Las cajas se pasan por una prueba de esterilidad que
consiste en incubarlas por 24 horas a 37 ºC.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las cajas
y los tubos son revisados. Aquellos que muestren
contaminación se desechan; por el contrario, los libres de
contaminación se refrigeran entre 4-15 ºC hasta su
utilización.
TINCIÓN
TINCIÓN DE GRAM
Introducción
En 1884 el médico Danés, Christian Gram, desarrolló un método de tinción que lleva
su nombre y que es de valiosa utilidad en cualquier Laboratorio de Bacteriología. La
técnica, además de revelar detalles referentes a la forma y agrupación bacterianas como
cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos:
GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS.
Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de peptidoglicano responsable
de la rigidez característica de la pared. Sin embargo, existen diferencias estructurales en
lo que respecta a las capas más externas. Así en las Gram Negativas, existe una membrana

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externa cuya constitución química es similar a la de cualquier otra membrana biológica
(fosfolípidos y proteínas) pero que posee además un alto contenido de lipopolisacáridos
(endotoxina).
Durante el proceso de tinción, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram
negativas, toman el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente decolorante, la
pared de las bacterias Gram positivas sufren una deshidratación que impide la salida del
colorante.
En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la
membrana externa, incrementando así su permeabilidad, lo cual permite la salida del
colorante primario.
Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fácilmente en las bacterias
Gram positivas debido a la deshidratación de su pared; además de que estas bacterias
quedaron (Laboratorio de Microbiología y salud Pública, pág. 18) previamente teñidas
con el colorante primario. Por el contrario, las bacterias GRAM (-) se tiñen fácilmente
con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram (+) se tiñen de
color violeta y las Gram (-) de rojo.
La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la
identificación de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos
en los cuales la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, por ejemplo: las
espiroquetas, las micoplasmas, las micobacterias, las clamidias y las rickettsias.
El método de la tinción de Gram ha sufrido varias modificaciones y algunas de estas
son incluso mejores que el método original. Los objetivos principales para modificar la
tinción han sido:
• Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que este se deteriora
rápidamente.

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• Reducir el tiempo requerido para completar la técnica.
Practica en el laboratorio
Materiales
Laminillas
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
Microscopio
Mechero Bunsen
Aceite de Inmersión
Cultivo de bacterias en medio líquido y sólido
Agua destilada
Colorantes para la tinción de Gram.
Preparación del frotis para tinción
Antes de teñir, se debe “fijar” el material que se va a observar. Los portaobjetos o
laminillas que se empleen para realizar las extensiones deben estar limpios y bien
marcados para su identificación y para la delimitación del área en que hay que colocar la
muestra, el portaobjetos puede dividirse en varias secciones con un lápiz graso y colocar
varias extensiones en una misma laminilla, a condición de que todas se vayan a teñir de
la misma manera.
Procedimiento
• La técnica para realiza el frotis bacteriano es variable, si el cultivo se encuentra
en medio sólido se procederá a colocar una gota de agua destilada en el
portaobjetos y con el asa se tomará una asada del cultivo, se mezclará bien. Si el

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cultivo se encuentra en medio líquido, tomar con el asa una pequeña gota de este
cultivo, colocarlo en el portaobjetos y se extiende.
• Al extender la gota sobre el portaobjetos formar una capa fina, frotis demasiado
gruesos NO SIRVEN.
• Secar los portaobjetos al aire o manteniéndolos sobre la llama del mechero de
Bunsen.
• Cuando se haya secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama del
mechero con la cepa hacia arriba, teniendo cuidado de no aplicar el calor en forma
excesiva ya que estropearía la morfología normal y la estructura de los
microorganismos que se van a teñir.
NOTA: Es importante recordar que la fijación por calor puede no matar las bacterias,
por lo que todas las laminillas deben de ser tratadas con el respeto y precaución inherentes
a todo objeto presuntamente patógeno.
Existen algunas variantes que pueden afectar los resultados de la tinción de Gram, por
ejemplo:
a. Las bacterias en los cultivos viejos (más de 24 Horas de incubación) liberan
enzimas por auto lisis. Estas atacan a la pared celular de las bacterias y
modifican sus propiedades estructurales, propiciando que las bacterias Gram
positivas se tiñan de rojo. Esta misma situación se puede presentar al observar
frotis directo de los tejidos de animales infectados.
b. Una decoloración excesiva puede ocasionar que las bacterias Gram positivas
se tiñan de rojo.
c. Una decoloración deficiente puede ocasionar que las bacterias Gram (-) se
tiñan de violeta.
d. Los frotis gruesos pueden teñirse irregularmente.

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Preparación de frotis “fijo” para tinción
Cubre el frotis con la solución de cristal violeta
(colorante primario). Cubrir el área del frotis, una o
dos gotas son suficientes. Agregar una cantidad
igual de la solución de bicarbonato de sodio, la cual
alcaliniza y acelera la tinción de las células. Deja
actuar esta mezcla por 15 segundos.
Lava con agua corriente (de la llave) a chorro de
agua. Sacude la laminilla para eliminar las gotas
gruesas de agua.

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Aplicar la solución de Iodo (Lugol, mordente) y
déjala actuar durante 15 segundos
Lava con agua corriente de la llave. Sacude el frotis.
Aplicar el Alcohol-Acetona (Agente decolorante)
durante 3 a 5 segundos.
Lava nuevamente con agua de la llave. Sacude la
laminilla.
Agrega la Fucsina básica (colorante de contraste) y
déjala actuar durante 15 segundos.
Lava con agua corriente de la llave
Seca el frotis por presión con una toalla absorbente
o al aire, y observa al microscopio con el objetivo de
inmersión

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PRUEBA DEHIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) AL 3%
La prueba de KOH al 3% nos permite ratificar los resultados de la tinción de Gram.
Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3% y con el asa
hacer en ella una suspensión de colonias de la bacteria problema, mezclando con
movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos. Si al separar el asa de la mezcla se forma
una hebra viscosa, esto indica que se trata de bacterias Gram (-). Si la hebra no se forma,
se trata entonces de bacterias Gram (+).
Gram Negativas; al separar el asa de la mezcla
queda entre ellas una hebra viscosa dentro de los 60
segundos a 3 minutos.
Gram positivas no existe dicha viscosidad.
TINCIÓN PARA BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE (BAAR)
Introducción
Las bacterias ácido alcohol resistentes forman un grupo de microorganismos se
definen con base en sus propiedades tintoriales. Son relativamente impermeables a los
colorantes básicos, pero una vez teñidos retienen el colorante con tenacidad, resistiendo
la decoloración con solvente orgánico acidificado (por ejemplo, alcohol-ácido).
La ácido-alcohol resistencia está determinada por la composición de la pared celular,
la cual además de contener peptidoglicano está constituida por un alto porcentaje de
glucolípidos hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son los ácidos micólicos.
La presencia de estas capas hidrofóbicas previene la penetración de soluciones acuosas,

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siendo esta la causa por la cual estos microorganismos no pueden teñirse con los métodos
convencionales (tinción de Gram).
Uno de los métodos de tinción más comúnmente usados para demostrar la ácido-
alcohol resistencia es el método de Ziehl-Neelsen. En este método la penetración del
colorante primario se facilita debido a que este se encuentra disuelto en fenol ya que es
aplicado en presencia de calor. Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana,
este se combina con las mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra
bacteria (ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y además reacciona con ácidos micólicos
libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva aún más hidrofóbica.
Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol resistentes como las
no ácido-alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el
agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-ácido, este no solubiliza los
lípidos de la pared de las bacterias ácido-alcohol resistentes se decoloran fácilmente, por
lo que se vuelven a teñir al aplicar el colorante de contraste. El grupo de bacterias ácido-
alcohol resistentes está representado principalmente por el género Mycobacterium.
Algunas especies de este género juegan un papel muy importante como agentes
etiológicos de la tuberculosis y otras enfermedades crónicas granulomatosas tanto en el
hombre como en los animales.
En el análisis de un frotis de material clínico sospechoso de contener bacilos
tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo ácido- alcohol resistente puede tener valor
diagnóstico, ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin embargo, la
interpretación del hallazgo de un solo bacilo ácido-alcohol resistente debe hacerse con
cautela y con base en la historia clínica y otras pruebas de laboratorio, ya que la presencia
de especies saprofitas de Mycobacterium podría conducir a un diagnóstico falso. Por otra

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parte, existen algunas especies de Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente
pueden comportarse como bacterias ácido-alcohol resistente.
Práctica en el laboratorio
Materiales
Laminillas
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
Microscopio
Platina caliente
Trozos de papel filtro
Aceite de Inmersión
Cultivo de bacterias
Agua destilada
Colorantes para la tinción de Ziehl-Neelsen.
Procedimiento
Utilizando una laminilla, prepara un frotis fijo (ya se te indicó el procedimiento
anteriormente) a partir del cultivo que vas a trabajar. Tíñelos siguiendo la técnica de
Ziehl-Neelsen, que a continuación será descrita.
Técnica de la tinción de ZIEHL-NEELSEN
• Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra solo
el frotis y no toda la laminilla.
• Humedece el papel con la Fucsina Fenicada (colorante primario). El frotis no
deberá secarse, así que añade continuamente colorante para evitar esto.

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• Permite la emisión de vapores durante 5 minutos. Retira el frotis de la platina,
quítale el papel, déjalo enfriar y lava con agua corriente de la llave.
• Decolora con el Alcohol-Ácido, permitiéndole actuar durante 2 minutos. Es
importante realizar la decoloración perfectamente, ya que de no ser así se corre el
riesgo de observar reacciones falsas positivas. Lava con agua corriente de la llave.
• Contrasta con azul de metileno de Loeffler durante un minuto.
• Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo
de inmersión.
¡RECUERDA!
Los microorganismos ácido -Alcohol-Resistentes se tiñen de color ROJO. Los no
ácidoAlcohol-Resistentes de color AZUL.
TINCIÓN PARA ESPORAS
Introducción
La espora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rígida, que es formada
por algunos géneros bacterianos. Los géneros bacterianos de interés en Medicina
Veterinaria que son capaces de esporular son Bacillus y Clostridium. Estos responden de
manera diferente al efecto que las condiciones ambientales tienen sobre la formación de
la espora. Por ejemplo; el B. anthracis, microorganismo aerobio estricto, solamente puede
formar esporas en condiciones de aerobiosis, de manera similar, los bacilos del género
Clostridium anaerobios, no forman esporas en aerobiosis.
La esporulación es un mecanismo especializado cuya función es encerrar un genoma
en un vehículo aislante que le permita la germinación posterior en un medio adecuado.
Las esporas bacterianas mantienen un estado de criptobiosis o vida latente, con escasa

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actividad metabólica. Así mismo, muestran una marcada resistencia al calor, a la
desecación, a la congelación, a diversos agentes químicos y radiaciones.
La espora bacteriana está compuesta por seis capas de afuera hacia adentro:
• Exosporium
• Capa
• Corteza
• Pared
• Membrana interna
• Centro (Protoplasma)
La capa está constituida por proteínas parecidas a la queratina, las cuales vuelven
impermeable a la espora y la protegen de la acción de substancias químicas. El centro
contiene dipicolinato de calcio, el cual aunado al alto estado de deshidratación del
protoplasma, es responsable de la marcada resistencia que muestra la espora al calor y a
la desecación.
Las esporas son estructuras ovales o esféricas que
pueden encontrarse tanto intracelularmente, como
fuera de la bacteria (célula vegetativa). Por su
localización dentro de la célula pueden ser centrales,
subterminales o terminales y presentan además
variación en su tamaño. Estas características son de utilidad taxonómica para la
identificación de algunas especies de los géneros capaces de esporular.
En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen como cuerpos
refringentes sin teñir. Para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer y Fulton en la que es
necesario aplicar calor para forzar la entrada del colorante primario (verde de malaquita)
y una vez que este ha penetrado, al lavar la preparación yagregar un colorante de contraste

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(safranina), las células vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece teñida de
VERDE.
Practica en el laboratorio
Materiales
Laminillas
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
Microscopio
Platina caliente
Mechero
Aceite de Inmersión
Cultivo de bacterias esporuladas
Agua destilada
Colorantes para la tinción de esporas
Procedimiento
Prepara dos frotis fijos a partir del cultivo que tienes en la mesa de trabajo. Uno de
los frotis será teñido utilizando la tinción de Gram y el otro será teñido con el método de
Schaeffer y Fulton como se describe a continuación:
• Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra solo
el frotis y no toda la laminilla.
• Aplica Fulton A (verde malaquita) y calienta en la platina, hasta la emisión de
vapores, durante un minuto (recuerda que el colorante no debe evaporarse, por lo
tanto, añadirás continuamente colorante para evitar esto).
• Lava con agua corriente de la llave.

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• Contrasta con Fulton B (safranina) durante 15 segundos.
• Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo
de inmersión (100X).
• El método de tinción de Schaeffer y Fulton puede practicarse en frío, permitiendo
actuar al Fulton A durante 10 minutos.
¡RECUERDA!
Con la tinción de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes SIN
TEÑIR, mientras que con el método de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de
color VERDE y las formas vegetativas se ven ROJAS.
SEROLOGIA PARA DETECTAR ANTIGENO
Prueba de Aglutinación
En las pruebas de aglutinación (Ejm. aglutinación con látex, coagregación), una
partícula (cuenta de látex, bacteria) se acopla con un reactivo antigénico o un anticuerpo.
La partícula compleja formada se mezcla con la muestra (como LCR o suero); si el
anticuerpo o el antígeno buscados están presentes en la muestra, producirán el
entrecruzamiento de las partículas, lo que se observa como una aglutinación.
Si los resultados son positivos, se
realizan diluciones seriadas de la muestra y
se prueban nuevamente. La aglutinación de
las soluciones más diluidas indica que
existen mayores concentraciones del
anticuerpo o del antígeno en estudio. El título se informa como la recíproca de la solución

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más diluida que produce aglutinación; Ejm, un título de 32 indica que la aglutinación se
observa hasta la dilución 1/32 de la concentración inicial.
Generalmente, las pruebas de aglutinación son rápidas, pero menos sensibles que
muchos otros métodos. También permiten determinar los serotipos de algunas bacterias.
ELISA
Esta es una prueba en la que usan complejos antígenos, anticuerpos (también
denominados inmunocomplejos) para medir la presencia de un analítico especifico de una
muestra. “Inmuno” se refiere a la respuesta inmunológica que hace que un cuerpo genere
anticuerpos y “ensayo” que se refiere a una prueba. Entonces, un inmunoensayo es una
prueba de inmunocomplejos cuando hay una unión Ag-Ac.
Los Ac son las bases de los inmunoensayos, ya que poseen un alta especificidad y
afinidad por un Ag especifico. Es la unión lo que permite la detección de analitos por
medio de una variedad de inmunoensayos
El método ELISA, se basa en el uso de Ag o Ac marcado con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan activad inmunológica como enzimática. Los tipos
son:
• ELISA no competitivo
- ELISA directo
- ELISA indirecto
- ELISA sándwich
• ELISA competitivo

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ELISA no competitivo:
Esta consiste en enfrentar la muestra con el Ag o el Ac que está en la fase sólida. Si
una muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado
reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
ELISA directo (para la detección de Ag)
Este consta de las siguientes etapas:
• Fijación del soporte insoluble “tapizado” de Ac específicos.
• Lavado con solución salina con agente tensoactivo (pH 7.2) para eliminar los Ac
fijados deficientemente o no fijados. Hay adición de Ag marcados “conjugados”
con una enzima, si los Ac reaccionan con los Ag quedará solubilizado.
• Lavado para eliminar los Ag marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado (espectrofómetros).
Elisa Indirecto (para la detección Ac)
• Se fija el Ag a la fase sólida, agregándose luego la muestra que se quiere investigar
el Ac correspondiente.

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• Posteriormente se adiciona un antigamablobulina fabricada contra su primer Ac
conjugado.
• Se incorpora a la reacción una enzima sustrato y luego un cromógeno de la
enzima.
• La cantidad de Ac presente será directamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado.
¡RECUERDA!
Antes de iniciar el procedimiento se deberá realizar un protocolo de trabajo.
PRUEBA DE INMUNOFLORESCENCIA
Es una técnica que se usa para la detección de estructuras subcelulares que nos
permiten estudiarlas con la utilización de anticuerpos acoplados a fluoróforos. Esta
prueba consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo
después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes con cortes de
tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única.
Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá
fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un

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acople a un anticuerpo de un fluorofóforo o una enzima que cataliza una reacción por la
cual se emite fluorescencia.
Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos, si se
utilizan dos con el mismo espectro de excitación, pero distinto espectro de emisión, se
pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).
La inmunofluorescencia es una técnica de biología molecular que consiste en incubar
una muestra con un anticuerpo que detecte la molécula o componente que queramos
detectar. Dicho anticuerpo lleva unida una molécula fluorescente (inmunofluorescencia
directa) o bien un reconocido por un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente
(inmunofluorescencia indirecta).
Inmunofluorescencia Directa
Esta técnica se vale de un anticuerpo primario marcado con un fluorocromo que
reacciona con el antígeno dentro de la muestra. Es un procedimiento de un solo paso y
comprende un solo anticuerpo marcado. La visualización de estructuras no es ideal a
causa de la poca emisión de señal.
Inmunofluorescencia Indirecta
Esta prueba tiene una sensibilidad
mayor que los métodos directos y con
frecuencia recibe el nombre de “técnica de
emparedado” o de “capa doble”. En vez de
conjugar un fluorocromo con un anticuerpo

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específico dirigido contra el antígeno de interés, el fluorocromo se conjuga con un
anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario.
DIAGNOSTICO MOLECULAR
Introducción
El principio que sustentó a los primeros métodos moleculares fue la hibridación de
una sonda de ácido nucleico caracterizada, destinada a una secuencia específica de ácidos
nucleicos en una muestra analítica, seguida de detección del par de híbridos. Por ejemplo,
se utilizó la sonda monocatenaria de DNA (o de RNA) para detectar RNA
complementario o DNA desnaturalizado en una muestra de estudio.
En forma típica se marca la sonda de ácido nucleico con enzimas, sustratos
antigénicos, moléculas quimioluminescentes o radioisótopos, para facilitar la detección
del producto de hibridación. Al seleccionar con cuidado la sonda o sintetizar un
oligonucleótido específico y realizar la hibridación en una forma muy estricta, la
detección del ácido nucleico en la muestra de estudio puede ser extraordinariamente
específica.

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Las evaluaciones o ensayos en cuestión se utilizan preferentemente para la
confirmación rápida de la identidad de un patógeno una vez que se detectó su
proliferación, por ejemplo, la identificación de Mycobacterium tuberculosis en cultivo
mediante la sonda de DNA Gen-Probe Inc. (San Diego, CA). El método Gen-Probe es un
ejemplo del formato de hibridación en que están en solución la sonda y la molécula o
elemento “destinatario”. Gran parte de las aplicaciones que se usan en laboratorios de
microbiología clínica utilizan formatos de hibridación en solución.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
En los métodos en cuestión se amplifica muchas veces DNA o RNA preescogidos. La
reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) se usa para
amplificar cantidades extraordinariamente pequeñas de DNA específico que está presente
en la muestra clínica y así es posible detectar las cantidades que inicialmente eran
pequeñísimas de ácido desoxirribonucleico. La PCR utiliza una DNA polimerasa
termoestable para producir una amplificación doble de DNA “preseleccionado” en cada
sitio de temperatura.
La PCR corriente utiliza tres reacciones seriadas: desnaturalización, hibridación y
extensión del cebador, en la forma en que luego será señalado. El DNA extraído de la
muestra clínica, junto con los oligonucleótidos específicos de los iniciadores, nucleótidos,
polimerasa de DNA termostable y amortiguador se calientan a 90-95°C para separar o
desnaturalizar las dos cadenas de DNA seleccionado. Se disminuye la temperatura de la
reacción, por lo común a 45 a 60°C, con base en los cebadores para permitir la hibridación
de éstos con el DNA preseleccionado.
Hecho lo anterior, se extiende cada cebador por medio de la DNA polimerasa
termoestable al agregar nucleótidos complementarios del DNA preescogido, y de esta

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forma se genera la amplificación doble. El ciclo se repite 30 a 40 veces hasta obtener la
amplificación del segmento de DNA preseleccionado, incluso 105 a 106 veces. El
segmento amplificado se puede identificar en el gel por electroforesis o detectar en los
análisis de inmunotransferencia de Southern por uso de sondas de DNA marcadas que
son específicas para el segmento, o por una variedad de técnicas comerciales de patente.
La PCR también puede realizarse en segmentos de RNA, método que ha sido llamado
PCR de transcriptasa inversa. La enzima recién mencionada se utiliza para transcribir el
RNA en el DNA complementario para amplificación.
En el comercio se cuenta con métodos de PCR para identificar patógenos bacterianos
y virales de muy diversa especie como Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, M.
tuberculosis, virus citomegálico, enterovirus y otros más. Se cuenta con un método para
evaluar el número (carga) de virus VIH-1.
Se conocen otras PCR creadas en laboratorios individuales para diagnosticar
infecciones. Son los métodos más indicados para el diagnóstico de innumerables
infecciones, en particular cuando no son útiles las técnicas corrientes de cultivo y
detección de antígeno; entre los ejemplos estarían la búsqueda del virus de herpes simple
en líquido cefalorraquídeo para el diagnóstico de encefalitis herpética, y la evaluación del
líquido de lavado nasofaríngeo para identificar una infección por B. pertussis (tos ferina).
Un aspecto importante en el caso de laboratorios que practican métodos de PCR es
evitar la contaminación de los reactivos o muestras con DNA del entorno, que pudiera
obstaculizar la diferenciación entre los resultados positivos verdaderos y los positivos
falsos, debido a la contaminación.

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PCR en tiempo real
Los progresos tecnológicos que han permitido contar con la “amplificación de tiempo
real” cuentan con plataformas de amplificación directa de ácido nucleico, con mejoría de
la sensibilidad de las técnicas de amplificación, y han disminuido impresionantemente la
posibilidad de contaminación.
Los instrumentos de tiempo real han sustituido al bloque sólido utilizado en los
termocicladores corrientes con ventiladores que permiten el ciclado más rápido de la
reacción en cadena de la polimerasa. Las mejoras impresionantes en los aspectos
químicos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos han permitido contar con
mezclas de reacción homogénea en las cuales aparecen compuestos fluorógenos en el
mismo tubo de reacción en que ocurre la amplificación.
Se utilizan diversas moléculas fluorógenas; incluyen colorantes inespecíficos como el
verde de SYBR, que se fija al surco pequeño de DNA bicatenario y métodos de detección
específicos con amplicón que usan sondas de oligonucleótidos marcadas con sustancias
fluorescentes, que pertenecen a tres categorías: sondas TaqMan o de hidrólisis; sondas de
transferencia de energía de fluorescencia (FRET, fluorescence energy transfer), y
señalamientos moleculares.
Rebasa los límites de este capítulo hacer un comentario completo de los métodos en
cuestión y convendría que el interesado consultara la obra coordinada por Persing et al.,
incluida en la bibliografía.
Todos los métodos permiten medir la fluorescencia en cada ciclo de amplificación, y
ello constituye la evaluación de “tiempo real” de los resultados. No es necesario abrir el

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tubo de la reacción para analizar los productos de PCR en un gel, y por ello existe menor
peligro de transportar amplicón residual, que influya en la reacción siguiente.

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GLOSARIO
Hidrolizados: reacción que disocia el agua en H+ y OH- por la acción de sustancias que
se combinan con una especie u otra.
Amplicón: conjunto de moléculas de ADN idénticas, resultado de una reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). esencialmente, se trata de un clon molecular.
Fotón: partícula mínima de energía luminosa o de otra energía electromagnética que se
produce, trasmite y absorbe.
Termocicladores: aparato usado en biología molecular que permite realizar los ciclos de
temperatura necesarias para la amplificación de diversas hebras de ADN en técnica de
PCR.
Cirus citomegalico: virus que se encuentra en todo el mundo. una vez que penetra en el
cuerpo de la persona, permanece ahí para siempre.
Cebador: dispositivo que sirve para el encendido de lámpara de descarga gaseosa,
especialmente tubos fluorescentes.
Oligonucleótido: es una secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares de base o
menos.
Hibridación: producción de híbridos.
Híbridos: procede de la unión de dos individuos de un mismo género, pero de especies
diferentes.
Inmunofluorescencia: es una técnica de inmuno marcación que hace uso de anticuerpos
unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una
determinada molécula.
Fluorocromo: sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de
onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de onda
característica.

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Patógeno: causa o produce enfermedad.
Anticuerpo: sustancia segregada por los linfocitos de la sangra para compartir una
infección de virus o bacterias que afectan al organismo.
Antígeno: sustancia que al introducirse en el organismo induce en este una repuesta
inmunitaria, provocando la formación de anticuerpos.
Sustrato: estracto que subyace a otro y sobre el cual esta en condiciones de ejercer algún
tipo de influencia.
Radio isotopo: isotopo de un elemento que presenta radioactividad. en cuestión resulta
radioactivo.
Espectrofotometro: instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en
función a la longitud de onda.
Aglutinación: proceso por el cual las células que están en suspensión en un líquido se
agrupan entre sí por reacción de un antígeno del cual son portadoras con el anticuerpo
correspondiente.
Coagregacion: se refiere a los microorganismos que forman o formarán la segunda capa
sobre aquellos que están previamente adheridos a la película, puede ser homotipica o
heterotipica.
Safranina: colorante biológico de contraste que se utiliza en la tinción de gram para
proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias gram positivas y tiñe de rosa a
la bacteria gram negativas.
Fenol: acido fenico, en su forma pura es un sólido cristalino de color blanco- incoloro a
temperatura ambiente.
Lugol: disolución de yodo molecular y yoduro potásico en agua destilada. se emplea
frecuentemente como desinfectante y antiséptico.

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REFERENCIAS
5th ed. American Society for Microbiology, 2007. En: Topley & Wilson’s Microbiology
and Microbial Infections, Medical Mycology, 10th ed. Merz WG, Hay RJ (editors).
Hodder Arnold, London, 2005.
25th ed, Jawetz, Melnick yAdelberg, Microbiología Médica.
Vol.I, Manual de pruebas de diagnostico y de las vacunas para animales terrestres
(mamíferos, aves y abejas), Organización Mundial de Salud, primera edición en español,
2004.
Vol II, Revista científica FCV de LUZ, Dot ELISA para diagnostico serológico de la
anaplasmosis y la babesiosis bovina, Montenegro Sonia – Toro Manuel.
Biomédica 2006, Evaluación de la prueba de inmunofluorescencia indirecta para el
diagnóstico de leptospirosis humana, Piedad Agudelo Flórez, Marcos Restrepo, María
Amparo Lotero, Instituto Colombiano de Medicina Tropical, Instituto de Ciencias de la
Salud (ICMT-CES), Sabaneta, Colombia.
4 th ed, Pathogenesis of bacterial infections in animals, Gyles Carlton, Presscott John F,
Songer, Thoen.