El documento describe la historia del desarrollo de los cultivos celulares, comenzando con los primeros experimentos a finales del siglo XIX de mantener células vivas fuera del cuerpo. Explica los avances clave en el desarrollo de medios de cultivo y técnicas que permitieron el establecimiento de líneas celulares. También describe los principales tipos de células y tejidos que se han utilizado para cultivos celulares, así como las organizaciones que clasifican y distribuyen líneas celulares.

1. Universidad
Simón Bolívar
Sartenejas, 05 de Junio 2011
Dra. Lola del Carmen
Rojas
1

2. Wilhelm Roux
(1850-1924)
Alexis Carrel (1912
premio nobel de
medicina)
•Rechlinhausen (1866): Mantuvo vivas
células sanguíneas de anfibio.
•Roux (1885): Células de embrión de pollo
en solución salina durante días.
•Harrison (1907): Cultivos de tejido
nervioso de rana.
• Alexis Carrel (1873-1944). Importantes
aportaciones al desarrollo de las ciencias
básicas de la medicina y de la cirugía
(anastomisis vascular).
•1940 – 1950:
Medios de cultivo
Antibióticos
Tripsina
SFB
Desarrollo, aplicabilidad y mejora de los
cultivos celulares como herramienta
fundamental para la investigación
2

3. Células: línea HeLa
Henrietta Lacks (1951)
Cáncer de Cérvix
Dr. George Gley
Biopsia
USO
-Vacuna
-Cáncer
-SIDA
-Efect- radiación y
sustancias
tóxicas.
-Mapeo genético…
3
Plasma de pollo
Extractos de embrión ovino
Suero de cordón umbilical
(+ 6 semanas: ÷ c/20hr)

4. 5

5. Harry Eagle Primero en llevar a cabo un análisis sistemático de los
nutrientes necesarios para sustentar el crecimiento de las células
animales en cultivo.
Eagle estudió el crecimiento de dos líneas celulares preestablecidas:
las células Hela y una línea de fibroblastos de ratón “L”.
6

6. 7
Medio de cultivo = Medio artificial
1. Mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas
complejas.
2. Mantienen las condiciones físico químicas adecuadas.
3. Crecimiento sobre soportes .
Limitación para establecer un Cultivo celular Medio
nutritivo adecuado.

7. Las células animales como los fibroblastos y las células epiteliales, se
adhieren y crecen en la superficie plástica de las placas usadas para el cultivo
celular.
Fibroblastos humanos C. Epiteliales humanas
8

8. GF
-Expresión de Integrinas
(>α2β1)
-Moléculas de adhesión.
-Organización del citoesqueleto:
•Polimerización α-actina.
•Formación Fibrillas de estrés.
Activación de la
mitosis, síntesis
prot. Matriz.
Placas de adhesión
Fibrillas de
estrés
Prot. de señalización:
Talina, tensina, FAK
9

9. http://simef.univalle.edu.co/colombiamed/Vol33No4/cm33n4a5.htm
Polimerización
de α-actina
Citoesqueleto
Modif. Forma
Mov. Cel.
Filopodio
Lamelipodi
o
Retracción
de los
filamentos
de Actina
10

10. núcleo Haz de actina
filopodio lamelipodio
cola
11
Placas
de adh

11. 13

12. Tejido, Órgano o Fragmento de órgano
Subcultivo CULTIVO SECUNDARIO
LINEA CELULAR
Subcultivos
LINEA CELULAR
Pasaje “n”
LINEAS CELULARES
LC FINITA (< div)
LC CONTINUA (α div)
LC TRANSFORMADA
LC NEOPLÁSICA
CULTIVO PRIMARIO
Confluencia
Digestión Enzimática
Listo para el experimento
14

13. Etapas en el establecimiento de un cultivo celular
El número de divisiones de una
célula normal es finito
Telomerasa activa
El número de divisiones de una
célula anormal es infinito
Límite de Hayflick
15

14. Cultivo Primario Confluencia Subcultivo
TRIPSINIZAR: 10-15 min/37°C
Inactivar la Tripsina: SFB
2 lavados con PBS 1X
Contar
Sembrar en placas para cultivo
Crecimiento en
suspensión (l S) ó
en monocapa
Migración
16

15. Tejido
Medio de cultivo
http://webdelprofesor.ula.ve/ciencias/chataing/Cursos/Biologia_General/cultivos_celulares.pdf
Saturación o
confluencia celular
inhibición por:
*monocapa:contacto
*
suspención:consumo
del medio
F. muerte
17

16. Tej.
Adiposo
Lipectomí
a
Obtención de Fibroblastos humanos a partir de tejido
adiposo
Medio de
transporte
estéril
Obtención por Migración 18

17. Tejido humano (Lipectomía): Fibroblastos
Día 5 Día 8
Día 10 Confluencia 19

18. Célula Madre Mesenquimal (MSC)
Se caracterizan por su capacidad de diferenciarse (pluripotentes) in vitro en varios
tejidos mesenquimales, que incluyen hueso, cartílago, tendón, músculo adiposo y
quizás, estroma de médula ósea.
Es posible aislar MSC a partir de médula ósea, periostio, hueso trabecular, tejido
adiposo, tejido sinovial, músculo esquelético, páncreas fetal, pulmón, hígado, líquido
amniótico, placenta, sangre de cordón umbilical y tejidos del cordón umbilical.
http://www.xpand-biotech.com/technology_bioreactor.htm
20

19. http://primicias24.com/salud/utilizan-celulas-madre-
de-cordon-umbilical-para-tratar-el-lupus/
http://www.uaz.edu.mx/histo/shisto/ojear/ct14.ht
m
V
A
A
Obtención de las células mesenquimales
Se corta fragmentos de
1-2mm2 para favorecer
la digestión
Digestión Enz
Migración
21

20. http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20I%20Euge.p
df
Obtención celular por Disgregación Mecánica
22

21. Expansión
Cultivo celular de MSC
al 20% de confluencia
Cultivo celular de MSC
al 40% de confluencia
Cultivo celular de MSC
al 60% de confluencia
Cultivo celular de MSC
al 70% de confluencia
Cultivo celular de MSC al
80% de confluencia (ideal
para expandir)
Cultivo confluente de
MSC
23

22. Gelatina de Warton (Tejido cordón umbilical): MSC
Día 3 Día 5
Día 9 Confluencia
24

23. Las células en el cultivo
primario crecen hasta la
confluencia.
Las células se recogerse de la
placa y se re-siembran en otra
(s) con baja densidad celular
para formar un cultivo
secundario
25
Digestión
enzimática

24. •HeLa
•PK-15 (riñón porcino)
•MDBK (Riñón bovino
Madin Darb)
•RK (riñón de conejo)
•VERO
26

25. http://www.atcc.org/CulturesandProducts/TissueBiology/PrimaryCells/tabid/1566/Default.as
Son organizaciones que se han encargado de clasificar y poner a disposición
múltiples líneas celulares a nivel mundial y son ellos los principales distribuidores.
European Collection of Cell Cultures (ECACC)
http://www.hpacultures.org.uk/collections/e
cacc.jsp
American Type Culture Collection (ATCC)
http://www.atcc.org/CulturesandProducts/TissueBio
logy/PrimaryCells/tabid/1566/Default.aspx
27

26. 28

27. 29

28. 30

29. 31

30. APOPTOSIS vs. NECROSIS
- La necrosis es una muerte accidental
debida a un estrés: choque térmico,
hipotónico, pH...
- Los métodos deben distinguirlas- La necrosis es una muerte accidental
debida a un estrés: choque térmico,
hipotónico, pH...
- Los métodos deben distinguirlas 32

31. Apoptosis Necrosis
TempranaCondensación de la cromatina Tardía
Se mantiene Se pierdeIntegridad de membrana
Disminuye AumentaTamaño celular
Se preservan Se desintegranOrgánulos
Fragmentación del DNA
Tardía
en fragmentos grandes
Temprana
en fragmentos
oligonucleosomales
En cuerpos apoptóticos
rodeados por membrana
Los contenidos
de los orgánulos
se liberan
Fragmentación celular
Programada genéticamente AccidentalMecanismo
Son reconocidos
y fagocitados
Inducen
inflamación local
Restos celulares
Diferencias entre
33

32. Activación de
caspasas
Pérdida de la
asimetría de la
membrana
Pérdida de la
integridad de
membrana /
Fragmentación
DNA
Fragmentación
en cuerpos
apoptóticos
Características morfológicas de la muerte celular
por Necrosis y Apoptosis
http://retina.umh.es/docencia/confsvivos/temas/apoptosis/apoptosis.html
34

33. 36

34. 37

35. 38

36. 39

37. % Viabilidad = DO células tratadas x 100
DO células control
D.O.: 490nm
Enzimas
Deshidrogenasas
40

38. http://www.promega.com/es-es/resources/multimedia/drug-discovery/multitoxfluor-multiplex-cytotoxicity-assay-animatio
Luminiscencia
41

39. Luminiscencia.- Fenómeno físico que consiste en la emisión de luz (no
debida a incandescencia), cuando una sustancia absorbe cualquier
tipo de energía.
Quimioluminiscencia.- Si en la emisión de luz interviene una reacción
química.
Fotoluminiscencia.- Si en la emisión de luz es consecuencia de la
absorción previa de una radiación. Puede ser de dos tipos:
•Fosforescencia, si la fotoluminiscencia persiste algún tiempo
después de cesar la radiación que la provoca.
•Fluorescencia, si la fotoluminiscencia se extingue al cesar la
radiación que la provoca.
ALGUNOS CONCEPTOS
42

40. http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/101/apolive-glo-multiplex-assay-
43

41. 44