3.1 Fundamento de la tinción de Feulgen. La tinción de Feulgen es una técnica de tinción descubierta por Robert Feulgen y usada en histología para teñir selectivamente el material cromosómico o ADN en células. Depende de la hidrólisis ácida del ADN. Esta técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de ácido clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales aldehídos de las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehído. El fundamento de este método se basa en la identificación altamente específica de ácidos nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehídos de la pentosa (azúcar). Para esto se realizan 2 pasos fundamentales: 1) Hidrólisis ácida: Se utiliza para romper los puentes de hidrogeno que unen a la doble hélice, mediante la desnaturalización de la cadena. Para esto se utiliza ácido clorhídrico (HCl), que es el componente reactivo más crítico del método, controlando la concentración del ácido, temperatura y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactación de cromatina) y fijador empleado. Durante la hidrólisis ácida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, por lo que, este material no reacción posteriormente con el reactivo de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases púricas (A y G) de los residuos de deoxiribosa (depurinización) formando ácido apurínico y generando grupos aldehído (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada. Este es un paso crítico por lo que hay que tener en cuenta las variables de tiempo de exposición a la hidrólisis acida, pH ([ H+]) al que se lleve a cabo la reacción, temperatura, el fijador utilizado en el tejido y el grado de compactación de la cromatina que depende de la naturaleza del tejido. 2) Tinción con Reactivo de Schiff: Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen son teñidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo aldehído libre endógeno y preexistente producido por el fijador (ej. glutaraldehído), tejido elástico inmaduro o algunos lípidos son removidos tratando el tejido con boro hidrato de sodio antes de ser teñido. (Ortiz, 2019) 3.2 Describir y explicar la Técnica completa. Opcionalmente, la muestra se puede contrateñir con Light Green SF amarillento. Finalmente, se deshidrata con etanol, se aclara con xileno y se monta en un medio resinoso. (Perez) 3.3 Características de las muestras que podemos teñir con esta técnica. Solamente el método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en donde es posible observar una intensidad de coloración proporcional a la concentración de DNA, por lo que es posible determinar cuantitativamente el DNA presente en el núcleo de las células, lo que se aplica en patología

1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CAMPUS IV
GENETICA APLICADA
PRACTICA 3. TINCION DE FEULGEN
PRESENTA:
• JUAN MARCOS BLAS GONZALES
• ITZEL MONTSERRAT COLMENARES OCAÑA
• ISMAEL DE JESUS HERNANDEZ
RODRIGUEZ
• NESTOR ABEL REYES LOPEZ
• SERGIO ULLOA ROBLEDO

2. TINCION
DE
FEULGEN
PRACTICA 3
9th
grade

3. Este método se basa en la identificación altamente
específica de ácidos nucleicos del ADN a partir del
reconocimiento de los grupos aldehídos de la pentosa
(azúcar).

4. Para esto se
realizan 2
pasos
fundamentales:

5. Hidrolisis ácida.
Rompe los puentes de hidrogeno
de la doble hélice, mediante la
desnaturalización de la cadena con
ayuda de HCl.
• ARN se divide en sustancias
solubles
• ADN se hidroliza parcialmente

7. Tinción con Reactivo de Schiff:
El reactivo de Schiff es un reactivo
para la detección de aldehídos.
Es un compuesto preparado a
partir de fucsina básica, HCl y
metabisulfito sódico o potásico.

8. Técnica
de la
tinción
de
Feulgen

9. ● La técnica de Feulgen consta de los
siguientes pasos:
● -Hidrólisis ácida: se introduce
directamente el portaobjetos en una
solución de HCL 6N durante 60
minutos a una temperatura de 25ºC.
● -Lavado de agua corriente durante un
minuto, seguido de otros dos lavados
de un minuto en agua destilada. Se
agitan suavemente los portaobjetos
con el fin de eliminar la mayor cantidad
de impurezas.

10. ● -Tratamiento con el reactivo de Schiff durante una hora a
una temperatura de 25ºC y en la oscuridad. Se procura que
los portaobjetos tengan la menor cantidad de agua posible
al entrar en el reactivo de Schiff, pero evitando que se
sequen. Durante todo el proceso los portaobjetos son
agitados suave y periódicamente.
● -Lavado en baño sulfuroso durante un minuto a temperatura
ambiente tres veces consecutivas para eliminar el exceso de
colorante.
● -Lavado en agua corriente de 10 minutos de duración.
● -Deshidratación y montaje de las muestras para su estudio.

11. Características de
las muestras que
podemos teñir con
esta técnica.

12. ● El método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en
donde es posible observar una intensidad de coloración
proporcional a la concentración de DNA.
● Depende del hidrólisis ácida del ADN
● Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen
son teñidos con reactivo de Schiff.
● Opcionalmente, la muestra se puede contrateñir con Light
Green SF amarillento .

13. Los resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teñido
color fucsia y fondo incoloro, en el caso de que de que se utilice una
coloración de contraste como el Fast Green FCF el fondo sería verde.

14. VENTAJAS Y
DESVENTAJAS
DE ESTA TECNICA

15. La reacción de Feulgen es una técnica semicuantitativa. Si los aldehinos sólo permanecen en
la célula son aquellos producidos desde la hidrólisis de ADN, entonces la técnica es
cuantitativa para el ADN. Es posible utilizar un instrumento conocido como
un microdensitometer o microspectrophotometer para realmente medir la intensidad de la
reacción de Feulgen rosa para un determinado orgánulo. Mediante este procedimiento, que
fue pronto determinaron que las células de la interfase fueron compuestas de dos
poblaciones, los diploide ADN y los tetraploide ADN

16. Ventajas
● Las muestras fijadas se mantienen estables
● durante mucho tiempo, el material se endurece, por lo que es
● fácil trabajar con él. Las enzimas tales como fosfatasa alcalina,
● esterasas inespecíficas, esterasa y lipasa específica permanecen
● activas después de la fijación con formalina.

17. Desventajas
● Investigaciones histoquímicas pueden llegar a ser difíciles
cuando las enzimas y epítopes son enmascarados. Sin
embargo el enmascaramiento puede ser parcialmente eliminado
por el lavado. El formaldehído puede causar problemas de
salud, es alergizante y un irritante químico.

18. CONTROL DE CALIDAD
* Limpieza y seguridad.
* Agitación del portaobjetos.
* Procura que los portaobjetos tengan
la menor cantidad de agua posible al
entrar en el reactivo de Schiff.
* Tras teñir 75 preparaciones se cambia
el baño reactivo.

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