Este documento presenta los resultados del estudio de las bacteriosis en cultivos de la concha negra Anadara tuberculosa utilizando técnicas "ómicas". Se identificaron dos bacterias patógenas mediante secuenciación masiva y se detectaron genes de toxicidad. La metagenómica reveló una pérdida de diversidad bacteriana y dominancia de Vibrio spp. en animales enfermos. La metabolómica identificó exotoxinas secretadas por Pseudomonas aeruginosa. La proteómica obtuvo huellas peptídicas espec

1. Noviembre 2017, Lima - Perú
Aplicación de las “omicas”
para el estudio de las
bacteriosis en cultivos de la
concha negra Anadara
tuberculosa
Benoit M. Diringer1,5., Krizia M. Pretell M,2., Karina Y. Zapata V. 2,
José E. González P. 2,3, Pedro M. Masias R.3, Virna A. Cedeño E.
2,4, Eric L. Mialhe3,
1Biotecoop, Tumbes, Perú.
2Universidad Nacional de Tumbes, Perú.
3Inca´Biotec SAC, Tumbes, Perú.
4Concepto Azul SA, Guayaquil, Ecuador.
5EPHE, Montpellier, France.

2. Introducción
El preocupante declino de poblaciones silvestres es asociado a
su sobreexplotación, a la degradación del hábitat, mortalidades
por factores abióticos y enfermedades infecciosas .
La posible desaparición de este recurso emblemático ha
conducido a proyectos de producción de semilla en laboratorio
en Perú [2] y Ecuador con fines; 1) de repoblamiento por
siembra masiva de semillas, y 2) como especie acuícola
alternativa.
La producción de semillas en laboratorio ha sido confrontada a
mortalidades por bacteriosis de diferentes etiologías. Las
disciplinas agrupadas como “omicas” en asociación con
infecciones experimentales facilitan la identificación y
caracterización de estas nuevas amenazas.
Estas técnicas se enfocan en el análisis de la información
genética o de la detección de genes de interés (genómica), del
estudio de los metabolitos producidos (metabolomica) y del
conjunto de proteínas expresadas (proteomica por el genoma
de un organismo en particular o de una mezcla compleja de
microorganismos (metagenómica) [3] .
La concha negra Anadara tuberculosa es
una especie bandera de los ecosistemas
manglar del Pacifico Oriental.
Es distribuida desde baja California,
México hasta Tumbes, Perú y su
comercio sostiene la economía de mas de
25 000 familias [1].

3. Materiales y métodos
1996.0 5612.4 9228.8 12845.2 16461.6 20078.0
Mass (m/z)
2516.2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 800 - CONCHA NEGRA IB 9-2 16; Run #4; Label I12
4801.8955(R223,S240)
4359.8730(R213,S225)
6292.5688(R315,S161)
6247.6670(R269,S117)
9500.9258(R531,S155)4418.5737(R247,S73)7151.6992(R348,S134)
7223.4673(R355,S112)
6375.4561(R551,S40)
9462.8018(R507,S60)
5349.0371(R343,S21)2339.0454(R307,S24)
9001.5996(R443,S34)
6847.9092(R322,S23)
10024.0801(R432,S23)
1
2
Cepa pura
Cultivo en caldo
Centrifugación y
recuperación del
sobrenadante
3
4
Análisis por MALDI TOF TOF
5 Identificación de
metabolitos
ATCCTAGTACTACGTCCAGTA
GTAGATCGCTAGGTTACATT
TCGCCTAGCCGTAGCAGTAC
TACGTCCAGTAGTAGTCAAA
GCTAGGTTACCTAGTACTAC
GTCCGTAAGTACTACGTCCA
GTAGTAGTACGCTAGGTTAC
AGTTTCAGTGCCTAGTACTAC
GTCCTAGGTTACATTTCGCCT
A
Extracción de sangre de animales
sanos (A) y moribundos (B)
Secuenciación
masiva “Next
Generation
Sequencing”
Análisis
bioinformático
Extracción de ADN total
Inyección intramuscular del
patógeno o agua salina
Corte del
musculo
1
2
3
4
Análisis
MALDI TOF
Pulverización
de matrice
Genomica Metagenomica
Proteomica /
MassIMetabolomica
ATCGG
Mortalidades en larvas (A) o
reproductores (B)
2
Cultivo bacteriano y purificación
de cepas
Extracción de ADN y PCR
Secuenciación
1
3
4
A B
A B 1
2
3
5 Búsqueda de
genes de
toxicidad

4. Identificación Sintomatología Muestra
Resultados - Genómica
Gen/toxina Ausencia Presencia
Exotoxina A (etA) X
Piocianina X
Pioverdina X
Tabla 1. Identificación en base a la secuencia de 16S ARNr de 2 bacterias
aisladas durante mortalidades de Anadara tuberculosa en cultivo
 Identificación
En eventos de mortalidades del 2015 – 2016, se identificaron a
2 bacterias posiblemente patógenas.
Larvas
Reproductores
Reproductores
Tabla 2. Detección de genes
de toxicidad en Pseudomonas
aeruginosa por PCR (etA) y
cultivo (Piocianina y
Pioverdina)
 Detección de genes de toxicidad
 Confirmación virulencia
Figura Tasas de sobrevivencias a los 35
días de adultos de A. tuberculosa
inyectados intramuscularmente con cepas
patógenas o solución salina.
Resumen resultados
 Identidad al 100% de 2 cepas
patógenas cultivables.
 Ausencia de principales genes de
toxinas  búsqueda por proteomica.
 Confirmación de patogenicidad de
cepas aisladas.

5. Resultados - Metagenómica
 Análisis comparativa
Punción intramuscular de sangre de adultos sanos y moribundos
(año 2016).
Resumen resultados
 Importante diversidad de bacterias circulantes en adultos sanos.
 Cuadro patológico se asocia a 1) perdida de cuantidades de
bacterias circulantes, 2) perdida de diversidad, y 3) dominancia de
generó patógenos (Vibrio spp.) pero infección multiespecifica.
Muestra N° Lecturas validas N° géneros N° especies
CN1 32291 116 229
CN2 44140 176 344
CN3 19676 108 169
CN4 27423 196 293
CN5 38789 259 481
CN enferm1 7735 8 30
CN enferm2 3881 21 67
Tabla 3. Evaluación de la microbiota de la sangre de adultos de Anadara
tuberculosa identificada en base su 16S ARNr por PGM (Ion Torrent).
Figura 2. Representación a nivel de genero de las bacterias circulantes
presentes en la sangre de adultos de A. tuberculosa
Dentro del genero Vibrio, se encontraba; V. spp. (52%), V.
parahaemolyticus (15%), V. harveyi (14%), V. alginolyticus (6%), V.
orientalis (2%) y V. vulnificus (2%).

6. Resultados - Metabolomica
 Análisis del exoproteoma
Se evaluó la presencia de toxinas secretadas por la bacteria
malacopatógena P. aeruginosa aislada de Anadara tuberculosa.
Resumen resultados
 Se pudo identificar 4 exotoxinas, el grupo Tc siendo muy
conocidos en entomopatologia.
 Las toxinas de los grupos TA son involucradas en la persistencia
celular, un mecanismo que genera infecciones crónicas.
Tabla 4. Identificación de fragmentos de péptidos de toxinas del
exoproteoma de Pseudomonas aeruginosa obtenidos por Shotgun
proteomic (Applied Biosystem 5800).
Secuencias Descripción
%
cobertura
%
identidad
AFFALETMPALEDGLR Toxin [P. fluorescens] 100% 100%
AGNIMAGAARVPQDGL
GQTPPKALHAR
HipA-like toxin module [P. syringae] 100% 100%
AAEPIDPPDEGTAREM
AR
Insecticidal toxin complex protein
TccB [Pseudomonas sp.]
100% 100%
AEVPSQFDQVFNDEGD
YR
Insecticidal toxin complex protein
TccA [P. brassicacearum]
100% 100%
NGAMDDHETYRYDSA
SQR
Insecticidal toxin complex protein
TccC [Pseudomonas sp.]
100% 100%
SSPSNSFECCWQASR
Hypothetical protein Toxin YGFx [P.
azotoformans]
100% 100%
Las complejos toxicos de tipo Tc, agrupan 3 entomotoxinas que
afectan al huésped de forma independiente o en sinergia [4].
HipA y YGFx son toxinas que pertenecen a 2 complejos TA
(toxina/antitoxina) distintos. Los TA son involucrados en la
apoptosis, respuesta a estrés, formación de biofilm, defensa a
fagos y generación de células persistentes [5,6].
.

7. 1996.0 5612.4 9228.8 12845.2 16461.6 20078.0
Mass (m/z)
2724.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 800 - CONCHA NEGRA IB 9-2 16; Run #4; Label H13
4430.2275(R332,S94)
2216.7295(R537,S22)
5355.1255(R191,S81)
6483.9639(R255,S89)
6039.8706(R408,S25)
6883.6777(R285,S38)
7839.2803(R357,S26)
Resultados - Proteómica
 Obtención “huellas peptídicas”
Resumen resultados
 Obtención de perfiles peptídicos específicos a cada patógeno por
MALDI simple TOF.
 Algunas masas de proteínas de estos perfiles pueden ser
visualizados en cortes histológicos.
 Requiere optimizar técnica para poder “caracterizar in situ las
proteínas” por MALDI TOF TOF
 Esta técnica permitirá a futuro detectar patógenos, caracterizar
toxinas y moléculas involucrados en la respuesta inmunitaria.
Figura 3. A) Perfiles péptidos de Pseudomonas aeruginosa y Vibrio
harveyi obtenidos por MALDI TOF. B) Imágenes de masas en cortes
histológicos de musculos de Anadara tuberculosa inyectadas con las
bacterias.
.
Se obtuvo el perfil peptídico de las cepas patógenas que fueron
inyectadas intramuscularmente en adultos de A. tuberculosa .
1996.0 4609.4 7222.8 9836.2 12449.6 15063.0
Mass (m/z)
3748.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 800 - SPOT SET IB - BACTERIA; Run #2; Label B23
9649.0215(R717,S419)
2060.9880(R813,S23)
9679.7656(R333,S50)
9540.2314(R718,S49)
3882.6577(R281,S29) 9855.8496(R821,S25)
6343.8926(R385,S35)
7656.2778(R485,S21)
Pseudomonas
aeruginosa
Vibrio
harveyi
Control
1
1
2
1
2
2
A
B

8. Conclusiones
Agradecimientos
.
Estos resultados fueron co-financiados por Inca´Biotec, la
Universidad Nacional de Tumbes y CONCYTEC a través de
fundos (CONVENIO DE GESTIÓN N° 015-2013-
FONDECYT, y R.P.Nº 206-2013-CONCYTEC-P.) y de becas
(K.P.M., K.Z.V, V.C.E, J.G.P.). B.D recibió una beca de la
Escuela Doctoral Franco-Peruana en Ciencias de la Vida.
El desarrollo de la acuicultura de nuevas especies acuáticas
puede ser impedido por la aparición de enfermedades de
diferentes etiología, en particular durante los cultivos larvarios
que son muy sensibles a las bacteriosis.
La aplicación de tecnologías de tipo omics permite de
diagnosticar e identificar rápidamente estas amenazas incluso
si los patógenos son desconocidos, mezclados, o no cultivables
por técnicas de microbiología clásica.
Nuestros resultados señalan que las mortalidades de A.
tuberculosa en cautiverio son consecutivas a vibriosis
multiespecificas asociadas a una perdida del microbioma de la
sangre o por infecciones por Pseudomonas que producen
toxinas de largo espectro.
Los futuros trabajos enfocarán en el desarrollo del “shotgun
proteomic-Mass imaging” que permitirán identificar, localizar
y semi-cuantificar no solamente a cualquier patógeno, a los
mecanismos involucrados en su virulencia, pero también a la
respuesta inmunitaria del huésped.

9. Referencias bibliográficas
Datos de contacto
1. FAO. (2007). Mangroves of South America 1980–2005: country reports. Forest
Resources Assesment Working Paper No. 140. Rome. www.fao.org/forestry.
2. Diringer, B., Vasquez, R., Moreno, V., Pretell, K., & Sahuquet, M. (2012). Peru
Project Studies Blood cockles for stock enhancement, Aquaculture. Global
Aquaculture Advocate, Ju-Agt, 48-50. 1151.
3. Marta Gómez M., Guo X., Tanguy A., He Y., Proestou D., (2015). The use of -omic
tools in the study of disease processes in marine bivalve mollusks. Journal of
Invertebrate Pathology. 131,, Pag.137-154.
4. Chen W., Hsieh F., Hsu F., Tasy Y., Liu J., (2014) Characterization of an Insecticidal
Toxin and Pathogenicity of Pseudomonas taiwanensis against Insects. PLoS Pathog
10(8): e1004288. doi:10.1371/journal.ppat.1004288
5. Hansen S., Vulic´ M., Min J., Yen T., Schumacher M., (2012) Regulation of the
Escherichia coli HipBA Toxin-Antitoxin System by Proteolysis. PLoS ONE, 7(6):
e39185. doi:10.1371/journal.pone.0039185
6. Masuda H., Tan Q., Awano N., Yamaguchi Y., Inouye M., (2012). A novel
membrane bound toxin for cell division, CptA (YgfX), inhibits polymerization of
cytoskeleton proteins, FtsZ and MreB in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett.;
328(2): 174–181. doi:10.1111/j.1574-6968.2012.02496.x.
Correspondencia: B.M. Diringer: diringerb@yahoo.fr, Cel. 965-381-633
Biotecoop, 242 Jr Filipinas, Tumbes, Perú.
Universidad Nacional de Tumbes, SN, Avenida Universitaria, Tumbes,
Perú.
Inca´Biotec Sac. 212 Jr Filipinas, Tumbes, Perú.
Concepto Azul SA, Circunvalación Norte 528B y Estero Salado, Urdesa
Norte 13, Guayaquil-Ecuador.
EPHE, CEDI, UMR DGIMI 1333, Université Montpellier 2, Bâtiment 24,
Montpellier-France.