07 pretell et. al. (Inca Bio)

1. DETECCIÓN DE Perkinsus sp. EN
EL BIVALVO Anadara tuberculosa
“CONCHA NEGRA” PERÙ-
ECUADOR.
Pretell Monzón, Krizia Maribel1; Zapata Vidaurre, Karina Yesenia2;
Masias Ramirez, Pedro Miguel3; Cedeño Escobar, Virna Alexi22,4;
Lignot, Jehan5; Mialhe, Eric2,3; Diringer, Benoit1,6
1) Biotecoop, Tumbes, Perú.
2) Universidad Nacional de Tumbes
3) Inca´Biotec SAC, Tumbes, Perú.
4) Concepto Azul SA, Guayaquil,
Ecuador.
5) Marine Biodiversity Exploitation
and Conservation (Marbec) Francia
6)EPHE, Montpellier, Francia.
Noviembre 2017, Lima - Perú

2. Introducción
Los patógenos del género Perkinsus son importantes parásitos
de moluscos que han causado considerables pérdidas en
poblaciones silvestres y cultivadas de bivalvos de importancia
comercial alrededor del mundo (Dang.et al., 2015).
Se han descrito siete especies de Perkinsus, dos de las cuales P.
marinus y P. olseni; son de notificación obligatoria a la
Organización Mundial de Sanidad Animal.(OIE, 2017)
En América del Sur han sido detectados cuatro especies del
genero Perkinsus: P. beihaiensis, P. marinus, P. olseni y P.
chesapeaki , que afectan severamente poblaciones de bivalvos
como : Crassotrea brasiliana ;C. rhizophorae (Dantes;2015).
Sin embargo, muchos de los estudios anteriores se basaron en
características morfológicas (crecimiento en medio RFTM),
por lo que el uso de técnicas adecuadas de diagnóstico para la
detección e identificación a nivel de especie es un desafío.
En Perú existen bancos naturales de moluscos bivalvos que son
explotados con fines de comercialización nacional y
constituyen el sustento de poblaciones rurales, como es el caso
de la “Concha negra” Anadara tuberculosa, cuyas densidades
poblacionales han disminuido drásticamente en los últimos
años (Ordinola, 2010). El objetivo del estudio fue detectar
mediante técnicas de diagnóstico molecular convencionales y
proteómica la presencia de Perkinsus en poblaciones silvestres
de A. tuberculosa en Tumbes- Perú
.

3. Materiales y métodos
A) Recolección de ejemplares
Figura 01: recolección de ejemplares y obtención de muestra
Esmeraldas
El Oro
Tumbes
Perú
Ecuador: Un 10% de cada lote de reproductores (03 lotes- 200
reproductores/Lot) provenientes de las 3 zonas fueron evaluados durante el
2015.
Perú: Un total de 60 individuos fueron recolectados en la zona de Puerto
Pizarro -Tumbes entre lo años 2016-2017
B) Detección por semi nested PCR
Amplificar la región ITS
de PK/ tres iniciadores.
Secuenciación animales
positivos
Extracción de tejido de interés Extracción ADN PCR
c) Visualización por microscopia electrónica
Individuo positivo
Fijación con formalina
10% por 24 h
Preparación y corte
histológico Marbec-Francia
1996.0 5612.4 9228.8 12845.2 16461.6 20078.0
Mass (m/z)
2516.2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 800 - CONCHA NEGRA IB 9-2 16; Run #4; Label I12
4801.8955(R223,S240)
4359.8730(R213,S225)
6292.5688(R315,S161)
6247.6670(R269,S117)
9500.9258(R531,S155)4418.5737(R247,S73)7151.6992(R348,S134)
7223.4673(R355,S112)
6375.4561(R551,S40)
9462.8018(R507,S60)
5349.0371(R343,S21)2339.0454(R307,S24)
9001.5996(R443,S34)
6847.9092(R322,S23)
10024.0801(R432,S23)
c) Determinación de Perkinsus por Shotgun proteomic
Disección de branquias Extracción de
proteínas totales
Esporteo en placa y
cobertura con matriz

4. Resultados
Tabla 01. Identificación molecular Perkinsus chesapeaki , muestras de Perú
 Identificación y prevalencia
Alineamiento Ident Acceso
Perkinsus chesapeaki 100% EU919501.1
Perkinsus chesapeaki 100% EU919499.1
La especie P. chesapeake fue identificada molecularmente (Tabla 01),
en reproductores asintomáticos de bancos naturales de Perú y Ecuador;
así como animales moribundo durante el periodo de aclimatación e
inducción al desove.
Tabla 02. Prevalencia de P. Chesapeake , con un 95% de confianza
Periodo Prevalencia (%) Procedencia
Año 2015 a 3.7
Reproductores provenientes de bancos
naturales- Ecuador (El Oro y Esmeraldas)
Año 2015 b 63.64
Reproductores moribundos- Aclimatación
y desove
Años 2016- 2017 5 Bancos naturales-Puerto Pizarro Perú
Figura 01. A) Reproductores presumiblemente sanos B y C) Animales
moribundos durante el cultivo.
A B C
Aparentemente algunos bivalvos son sensibles a ciertos Perkinsus y
“portadores asintomáticos” de otros. Sin embargo, Dang et al., 2013
demostró que la presencia de Perkinsus afecta las funciones fisiológicas
de estos animales “resistentes” reduciendo de hasta un 25% su
crecimiento.

5. Resultados II
 Histopatología de animales positivos
Fig 02:Detección de trofozooitos maduros de Perkinsus sp en
branquias de A. tuberculosa mediante microscopia electrónica.
 Análisis proteómico
Fig 03: Secuencias de péptidicas obtenidas a partir de branquias de
A. tuberculosa mediante “Shotgun proteomic”.
Permitió la detección de 5 positivos en las 60 muestras
evaluadas con una prevalencia de 8.3% y detectar un total de
14 secuencias peptídicas.
Esta técnica permite la detección de proteínas de interés a
partir de un complejo mixto y posee muchas ventajas frente a
otros métodos de diagnóstico (rapidez, trabajar mayor número
de muestras, etc), sin embargo su sensibilidad y especificidad
deben ser validada con mayor número de muestras y
comparada con el diagnostico por PCR y crecimiento en medio
RFTM: Establecer como método diagnostico de rutina

6. Conclusiones
Agradecimientos
Estos resultados fueron co-financiados por Inca´Biotec, la
Universidad Nacional de Tumbes y CONCYTEC a través de
fundos (CONVENIO DE GESTIÓN N° 015-2013-
FONDECYT, y R.P.Nº 206-2013-CONCYTEC-P.) y de becas
(K.P.M., K.Z.V, V.C.E, J.G.P.). B.D recibió una beca de la
Escuela Doctoral Franco-Peruana en Ciencias de la Vida.
• Primer reporte de P. chesapeaki mediante técnicas
moleculares dirigido a la región ITS en animales
asintomáticos y moribundos en sistemas de cultivo.
• Es necesario orientar investigaciones en la patología de
A. tuberculosa (infección experimental) frente a P.
chesapeaki, y evaluar los factores físicos que
desencadenarían un posible brote (temperatura,
salinidad; etc).
• Es el primer reporte del uso del Maldi Tof Tof en modo
Shotgun proteomic, como herramienta de diagnóstico
de Perkinsus en moluscos.

7. Referencias bibliográficas
Datos de contacto
Correspondencia: K.M. Pretell: krizmar_5@hotmail.com, Cel.
972 896 587.
Biotecoop, 242 Jr Filipinas, Tumbes, Perú.
Universidad Nacional de Tumbes, SN, Avenida
Universitaria, Tumbes, Perú.
Inca´Biotec Sac. 212 Jr Filipinas, Tumbes, Perú.
Concepto Azul SA, Circunvalación Norte 528B y Estero
Salado, Urdesa Norte 13, Guayaquil-Ecuador.
EPHE, CEDI, UMR DGIMI 1333, Université Montpellier 2,
Bâtiment 24, Montpellier-France.
 Audemard, C., Carnegie, R., & Burreson, M. (2008). Shellfish tissues evaluated for
Perkinsus spp. using the Ray’s fluid thioglycollate medium culture assay can be used
for downstream molecular assays. Diseases of aquatic organisms, 80(3), 235-239.
 Arzul, I., Chollet, B., Michel, J., Robert, M., Garcia, C., Joly, J. P., & Miossec, L.
(2012). One Perkinsus species may hide another: characterization of Perkinsus
species present in clam production areas of France. Parasitology, 139(13), 1757-
1771.
 Dang, C., Dungan,F ., Scott, G ., Reece,K. (2015). Perkinsus sp. infections and in
vitro isolates from Anadara trapezia (mud arks) of Queensland, Australia Perkinsus
sp. infections and in vitro isolates. from Anadara trapezia (mud arks) of Queensla
nd, Australia. Vol. 113: 51–58
 Organización Mundial de Sanidad animal. (2017). Manual de las Pruebas de
Diagnóstico para los Animales Acuáticos OIE. Recuperado de
http://www.oie.int/es/normas-internacionales/manual-acuatico/acceso-en-linea/
 Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J., & Mann, M. (2007). In-gel
digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature
protocols, 1(6), 2856-2860.