Identificación de proteínas en progresión de Hepatitis B grave
1. Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Bioanálisis Clínico
INTEGRANTES
Javiera Inostroza Zúñiga
Gustavo González Valenzuela
2. Identificar las proteínas mas importantes en
la progresión del grado leve a grave de la
Hepatitis B
3. VHB
Problema mundial
Enfermedad crónica
Secuelas
Cirrosis
Carcinoma hepatocelular
4. Potente inhibidor de las proteasas séricas
70 variedades
Expresión alta normal en tejidos
Expresión baja patológica (HBCG y CH)
Niveles séricos altos
5. 31 pacientes con HBC (13 leves y 18 graves)
10 pacientes convalecientes de HBA
18 pacientes con CH relacionado con VHB
12 individuos sanos (controles negativos)
6. Exclusiones:
Hepatitis C y D
VIH-1 (+) pero VIH-2 (-)
HBsAg (+)
Otras enfermedades con daño hepático crónico
7. Sangre venosa
Centrifugación a 2000 g por 10 min
Sobrenadante almacenado a -80 °C
Albumina sérica e IgG fueron removidas
Concentración proteica determinada por
método de Bradford
8. • Cultivo
• Electroforesis • Cosecha
• IEF • Transferencia • SDS-PAGE
• SDS-PAGE • Inmunotinción • WB
• Tinción • Autoradiografía
Cultivo
2-DE Western Blot
celular
PMF Microarray
de tejidos
• Digestión
• MALDI-TOF • Microcortes
• Análisis de datos • Inmunotinción
9. Isoelectroenfoque (IEF)
Electroforesis SDS-PAGE
Tinción con nitrato de plata
Desventaja
Evidencia expresión y presencia
No se puede dilucidar el origen
10.
11.
12. Corte del gel
Lavado y desteñido
Deshidratación
Secado
Digestión
Extracción de fragmentos
17. Búsqueda en base de datos (NCBInr)
Parámetros de búsqueda
1. Rango de masa del péptido de 1000 a 3000 U
2. Se permiten modificaciones carbamidometil y oxidaciones
3. Se permite la pérdida de un sitio de clivaje
4. Precisión de masa de +/- 1U
5. Se establecen restricciones sobre las especies de Mus
18. Criterios de identificación positiva
Criterios identificación (+)
1. Partidor MS consta de mínimo 4 péptidos
2. Péptidos encontrados coinciden por lo menos en 20%
con la secuencia de la proteína completa
3. 100 ppm o mejor (precisión de masa)
23. La evaluación de AAT fue basada en la tinción celular positiva
en una escala de 3 puntos: 0 para ausencia de tinción, +1 para
tinción moderada y +2 para altamente teñido.
24. Parámetros Características
Células Chang, HepG2, Huh7, BEL-7402,
Líneas celulares
SMMC-7721 y 2215
Medio DMEM
Suero fetal de Bovino 10% (v/v)
Suplementos
Antibióticos
37 °C
Incubación CO2
Atmósfera humidificada
25. Incubación Lisis celular Agitación
Fase de crecimiento Centrifugación
Cosecha con tripsinizacion
Sobrenadante
Tampón de carga
Se hierve por 10 min.
26.
27. 2-DE asociado a PMF
AAT alta en suero CH y HBG
En suero: no se puede determinar origen AAT
Discrepancia de expresión suero/tejidos