6. DNA have ("CpG islands"), which are recognized by the enzyme DNA
methyltransferase, which during DNA replication carbon 5 methylated cytosine of the
newly synthesized strand, thus maintaining the methylated state memory daughter
DNA molecule
7. Gen DNMT1
In this study was important because it
manages to have action on the stem cell to
ensure in all sequences of dna methylation
They were able to identify that inhibir this
factor which is the more important during the
metilation , to occurs a hypomethylation
which leads to an improvement in patients
with LES
8. • DNMT1-• Hipometilaci
on ihbibiting
the DNMT1
• CD4+ T cell its
someting to UVB
• LES
Autoin
mune
disease
Affecting
OF CD4+ T
CELLS
The most
important
in
metilation
The
hipometil
ation
enhances
the LES
9. General objective
the objective of this study was to obtain the CD4 + and expose them
ultraviolet rays and watch dose occurs a change in DNA methylation and that
causes about patients with this reduction brings them taking into account the
time of exposure dose and the improvement in symptoms, and if to obtain
the result you can be beneficial to the patient and be able to include as a
white effective therapeutic.
13. Rango entre 290-320 nm pico de 310 nm
Irradiada con PBS con
Mg2+/Ca2+
A distancia de 40cm Dosis de 20, 40 or 80 mJ/cm2. .
se agregó el medio
de cultivo de células
t humanas y
fueron cultivadas
para dosificación de
24 h.
Exposición UVB
14. La metilación del ADN
global fue evaluada por
las células con tinción
anticuerpo monoclonal
específico contra 5-
methylcytidine
Células CD4 fueron
lavadas con (SAFT-bsa)
Luego se fijo con
paraformaldehido.
seguido por
tinción con cabra
anti-ratón igG
conjugado con
fluoresceína
Se neutralizaron y se
incubaron con anti-5 -
methylcytidine
anticuerpo
Análisis por citometría de flujo
15. Amplificación del
RNA
Síntesis de su
cDNA
Con transcriptasa
inversa
Varios ciclos
de DNA
convencional
Determina
expresión de genes,
diferentes tejidos
16. Transcripción reversa se realizó utilizando el kit de rt-pcr
primescript
QRT-pcr fue realizada en sistema de tiempo real usando sybr
premezcla ex taq
amplificación se inició en el 95c durante 30 s como el primer
paso
seguido por 40 ciclos sucessivos de pcr: 95 c durante 5 s, a
60 8c para 20 s.
Los primer de takara bio fueron:
DNMT1 forward: 50-GCACCTCATTTGCCGAATACA-30;
reverse: 5’-TCTCCTGCATCAGCCCAAATA-3’
b-actin forward: 5’-ACCCAGATCATGTTTGAGACC-3’
reverse: 5’-AGGGCATACCCCTCGTAGA-3’
18. las membranas fueron sondeadas
con dnmt1 anti igG de conejo anticuerpo o
conejo anti-glyceraldehyde-3-fosfato
deshidrogenasa (gapdh)
bandas de proteínas fueron
detectadas
utilizando el kit de brisa
occidental densitométrica
Análisis de la banda de la proteína se
realizó utilizando software imagej
19. Se hace para determinar la actividad catalítica de la
enzima DNMT1
20. RESULTADOS
Regulación a la baja de la expresión de RNAm de
DNMT1 contribuye a la hipometilación del ADN a
nivel global en las células TCD4 de pacientes con LES.
• Los resultados mostraron que el nivel de metilación del
ADN en las células T DC4 en pacientes con LES fue
significativamente menor que el del grupo control.
22. RESULTADOS
UVB mejoro la hipometilación del ADN de manera
dependiente de la dosis en las células T CD4 en
pacientes con LES.
• Exposición de las cell T CD4 a O, 20, 40,60 mJ/cm².
• Diferencia en el nivel de metilación del ADN entre
>20 mJ/cm² y 0 mJ/cm².
• Nivel de metilación del ADN es < para las células
tratadas con 40 y 80 mJ/cm².
23. RESULTADOS
La metilación de las células T CD4 en pacientes con
LES fue sensible a la exposición de UVB de forma dosis
dependiente.
• No diferencia significativa entre 20, 40, 80 mJ/cm².
En los controles sanos .
• Nivel de metilación del ADN se redujo en las células
después de 40 y 80 mJ/cm².
• A 20 mJ/cm². no alcanzo significación estadística.
25. RESULTADOS
UVB no afecta la expresión de DNMT1 y proteínas en
las células T CD4 en paciente con LES.
• Se investigo el efecto de la exposición a UVB en la
expresión de DNMT1 y proteínas.
• Resultados No hay cambios significativos = la
expresión no se afecta con UVB.
27. RESULTADOS
• Los niveles de expresión de DNMT1 no mostraron
una diferencia.
• Se encontró expresión de DNMT1 en las células T
CD4 después de diferentes dosis de exposición a
UVB.
28. DISCUSSION
RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE
Kastan Found that DNA methylation
level was decreased after UVB
exposure by studying in a
phage DNA model.
x
Zhu We showed the level of global
DNA methylation in CD4+ T
cells from SLE patients was
significantly lower than that
from the control group, which
indicated CD4+ T cells DNA
hypomethylation was crucial
for the development of SLE.
x
29. DISCUSSION
RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE
Wang The data showed global DNA
methylation level was
significantly decreased in CD4+ T
cells from SLE patients after 40
and 80 mJ/cm2 UVB exposure
whereas no significant
difference was found after 20
mJ/cm2 UVB exposure.
x
30. DISCUSSION
RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE
Wang The data showed global DNA
methylation level was
significantly decreased in CD4+ T
cells from SLE patients after 40
and 80 mJ/cm2 UVB exposure
whereas no significant
difference was found after 20
mJ/cm2 UVB exposure.
x
31. CONCLUSION
• DNMT1 expression level is significantly
positive in SLE patients.
• The down regulation of DNMT1 mRNA
expression contributes to DNA
hypomethylation.
• This project is very important for new
therapeutics targets.
• UVB DNA hypomethylation improve but are
dose dependent.
