El ibrutinib como inhibidor de la BTK, Utilizado en tratamientos de canceres.

1. DANIELA ALARCÓN BOLÍVAR
ANÍBAL CABRALES LÓPEZ
MEDICINA
UPB-2014

2. INTRODUCTION
Chronic lymphocytic leukemia is the most common type in adults. There is
a defect in receptor signaling B cells, specifically in the BTK
A therapeutic advance is the development of antagonists such as ibrutinib.
This seems to be more effective compared to other as imatinib for have
different properties.
The administration of these drugs can cause mutations, which generate
resistance.

3. INHIBIDOR
• Ibrutinib is an irreversible enzyme inhibitor of BTK, that binds to the site
C481 and has been shown to have clinically significant activity in patients
with relapsed CLL.
• Ibrutinib promotes apoptosis, inhibits proliferation, and also prevents the
survival of tumor cells, inactivating the enzyme BTK.

4. BRUTON'S TYROSINE KINASE
• The BTK is necessary for the development, differentiation and signaling of B
lymphocytes, alteration is associated with two diseases, X-linked agammaglobulinemia
and chronic lymphocytic leukemia.
• It acts by phosphorylating the enzyme PLC Gamma 2
• It has an important immune function, in immune innate and adaptive system

5. OBJETIVO GENERAL
• IDENTIFICAR LA RESISTENCIA AL INHIBIDOR IBRUTINIB ASOCIADA A
MUTACIONES EN DIFERENTES ENZIMAS COMO LA BTK Y LA PLC GAMA 2 EN LA
LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA.

6. MATERIALES Y MÉTODOS
• AISLAMIENTO DE DNA HUMANO:
1. Lisis celular de GR y nuclear de GB
2. Tratamiento con RNAasa (opcional)
3. Precipitación de proteínas
4. Precipitación de DNA
5. Almacenamiento de DNA con TE (TRIS y
EDTA)
Extraído de esta forma el
DNA puede ser evaluado en
diferentes pruebas
moleculares.

7. MATERIALES Y MÉTODOS
SECUENCIACIÓN DEL DNA: Existen diferentes tipos
• Maxam-Gilbert: está basado en la transformación
química del DNA y la separación de bases
específicas.
• Terminación de la cadena: fue desarrollado por
Sanger. Se basa en la formación de una nueva
cadena de DNA con didesoxinucleótidos trifosfato
(ddNTPs) mediante la actividad de una DNA
polimerasa
• Ion Torrent: está basada en la detección de los
iones de hidrogeno generados en la polimerización
del DNA, utiliza polimerasas naturales por tanto la
reacción ocurre en tiempo realSe extrajo el ADN
 Permite conocer la secuencia de
nucleótidos de un fragmento de
DNA
 Permite detectar cualquier mutación
en un gen determinado y establecer
el perfil alélico de un individuo
 Se aplica en la caracterización e
identificación del genoma humano

8. MATERIALES Y MÉTODOS
PCR:
• Desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas:
calentamiento
• Alineamiento: Hibridación específica de la hebra sencilla con
primer y DNTp’s
• Síntesis: replicación de la hebra sencilla por una DNA
polimerasa a partir de un primer como cebador
Para realizar la PCR se necesita principalmente:
 DNA Plantilla
 Primers que hibridan con regiones específicas conocidas
como DNA
 DNT’ps
 DNA polimerasa
Su objetivo es la amplificación
directa de una secuencia de
DNA o indirecta de una de
RNA.
Algunas funciones:
 Clonación
 Secuenciación
 Plimorfismos
 mutaciones

9. MATERIALES Y MÉTODOS
• TRANSFECCIÓN: técnica empleada para introducir
fragmentos de DNA adicional en células de mamíferos
mediante plásmidos, virus u otras herramientas para la
transferencia.
- Electroporación
- Liposomas: se fusiona con la membrana e introducen el
material
 Transitoria: el DNA fransfectado al no ser insertado en el
genoma se pierde en la mitosis
Estable: se debe añadir un gen que proporcione una
ventaja adaptativa, como la resistencia. Una porción de las
Permitir la introducción de ácidos
nucleicos en el interior de las células,
esto ha permitido en gran medida
ampliar los conocimientos acerca de
la regulación génica

10. MATERIALES Y MÉTODOS
ENSAYO ENZIMÁTICO INVITRO
• Se utilizaron células HEK (Células embrionarias
humanas) que expresaban EBNA (Epstein-Barr Nuclear
Antigens)
• Las proteínas fueron purificadas por cromatografía de
afinidad, esta permite separar mezclas proteicas por su
afinidad o capacidad de unión a un determinado
ligando.
• Las proteínas purificadas fueron utilizadas en el ensayo
enzimático de quinasa: ensayo químico para medir
actividades enzimáticas. Permite conocer la cinéticas
enzimáticas y la inhibición enzimática.

11. MATERIALES Y MÉTODOS
• CITOMETRIA DE FLUJO: permite analizar una
población de proteínas en una muestra donde
hayan diferentes poblaciones, además brinda,
analiza y correlaciona diferentes datos como
tamaño celular. Es de gran especificidad.

12. MATERIALES Y MÉTODOS
• INMUNOBLOT:
1. Separación de proteínas por electroforesis en gel SDS-
PAGE según su tamaño
2. Transferencia a un filtro con anticuerpos
3. Se evidencia cual contra cual proteína está dirigido el
anticuerpo
En la práctica clínica se utiliza
para diagnosticar
enfermedades infecciosas
como el VIH.

13. RESULTADOS

14. RESULTADOS

15. DISCUSSION

16. CONCLUSIONS
1. The ibrutinib is the most important irreversible BTK inhibitor and is relevant for treating
CLL and many others cancers.
2. The c481s mutation in BTK confers relative resistance to ibrutinib by preventing
irreversible binding.
3. The resintance of irreversible BTK inhibitors is give through mutation of a cysteine
residue in a binding site.
4. When the acts ibrunitib, inactive kinase and induces apoptosis of cells with CLL

17. BIBLIOGRAFÍA
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BARCELONA. ESPAÑA. 346 PÁGS.
• OLIVA VIRGILI RAFAEL; VIDAL TABOADA JOSÉ MANUEL. 2006. GENOMA HUMANO:
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HTTP://WWW.JAVERIANA.EDU.CO/FACULTADES/CIENCIAS/NEUROBIOQUIMICA/LIBROS/
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• AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY. [FECHA DE CONSULTA: 10 AGOSTO 2014].
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• MARTÍNEZ SÁNCHEZ LINA MARÍA… [Y OTROS]. 2012. 7ª ED. LIBRO DE CLASE. BIOLOGÍA
MOLECULAR. EDITORIAL UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA. MEDELLIN.

18. Daniela Alarcón B.