Vacunas frente al virus de la fiebre aftosa

1. Caracterización de la respuesta
inmune inducida en ratón por vacunas
frente al virus de la fiebre aftosa
basadas en cápsidas quiméricas de
Calicivirus.

2. Vacunas basadas en capsidas vacías
Ventajas:
• Seguridad (vacunas de subunidad, no virus infectivo)
• Presentación multimérica de epítopos antigénicos.
• Capaces de estimular respuesta celular.
• No requieren adyuvantes.
• Pueden inducir protección por vía oral y nasal.
• Pueden inducir inmunidad sistémica y en mucosas.
VLPs = Virus-like particles (capsidas vacías)

3. Vacunas basadas en VLPs de Calicivirus
VLPs del Virus de la Enfermedad Hemorrágica
del Conejo (RHDV), buenas candidatas:
• Están compuestas por una única proteína estructural.
• Son altamente inmunogénicas.
• Son bastante estables.
• Pueden purificarse fácilmente en grandes cantidades
(sistema de baculovirus).
Precedente: Las VLPs del virus Norwalk (Calicivirus
humano del género Norovirus) inducen respuesta
inmune sistémica y en mucosas en ratones
inoculados por vías oral e intranasal.

4. Vacunas basadas en VLPs quiméricas
Son VLPs a las que se ha insertado secuencias heterólogas.
Para vacunas: Secuencias inmunogénicas (epítopos B y T).
Nuestro objetivo: Producir VLPs quiméricas de Calicivirus que
contengan epítopos B y T del virus de la fiebre aftosa.
VLPs quiméricas
Cápsida de Calicivirus: 180 copias
proteína estructural.
VLP quimérica: puede presentar 180
copias del epítopo insertado.

5. VP60
Bac-VP60
Baculovirus
Plásmido
Recombinación
Homóloga
Construcción de baculovirus recombinantes Bac-VP60
(en cultivos celulas de insecto)(virus dsDNA 136Kb)
Expresión en células de insecto

6. CARACTERIZACION ESTRUCTURAL DE LAS VLPs DE RHDV
Paso previo a la construcción de VLPs quiméricas
Condiciones de los sitios de inserción:
• Sitios que no eliminen la capacidad de autoensamblaje
de las VLPs.
• Sitios que estén expuestos hacia el exterior y
accesibles al sistema inmune.

7. Análisis mutacional de la proteína VP60
VP60
NTDA3
CTDA3
NT29
CT30
579
550
549
593
592
DA3
DA3
518
476
NT61
NT103
CT60
CT100
519
479
NT42 537
Estudio de la capacidad de los mutantes para autoensamblarse formando VLPs

8. Construcción
Formación
VLPs
VP60 SI (40 nm)
NT29 SI (27 nm)
NT42 SI (27 nm)
NT61 SI (27 nm)
NT103 NO
CT30 NO
CT60 NO
CT100 NO
NT-DA3 SI (40 nm)
CT-DA3 SI (40 nm)
Análisis mutacional de la proteína VP60
Estudio de la capacidad de los mutantes para autoensamblarse formando VLPs
VP60 NT29 NT42
NT61 NT-DA3 CT-DA3
Microscopía electrónica (tinción negativa)

9. VLPs RHDV VLPs NV VLPs RHDV
180 copias 60 copias
Modelo estructural de la cápsida de RHDV
Criomicroscopía y procesamiento digital de imágenes
180 copias

11. LOCALIZACION DE EPÍTOPOS T Y B
INMUNODOMINANTES EN EL
VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA
Proteínas
maduras
VP4
2A
L/L’ VP2 VP3VP1 2B 2C 3A
3B
3C 3D
Péptido BPéptido T
(Sitio A)
140 160 20 34
Péptido T
Induce anticuerpos
neutralizantes
Esther Blanco
Motivo RGD

12. RGD 26
ggatccactacgacctacaccgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacgacgacgcatgctcggcatttgccgtga
G S T T T Y T A S A R G D L A H L T T T H A R H L P
RGD 22
ggatccaccgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacgacgacgcatgctcggcatttgccgtga
G S T A S A R G D L A H L T T T H A R H L P
RGD 19
ggatcc cgacgcatgctcggtga
G S T A S A R G D L A H L T T T H A R
RGD 14
ggatccaccgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacgtga
G S
T3A22
ggatccgcagccattgaattctttgagggcatggtacacgactccattaaggaggaactccggccctga
G S A A I E F F E G M V H D S I K E E L R P
T3A17
ggatccgcagccattgaattctttgagggcatggtacacgactccattaagtga
G S A A I E F F E G M V H D S I K
TVP417
ggatccataattaacaactactatatgcagcagtaccaaaactccatggactga
G S I I N N Y Y M Q Q Y Q N S M D
Inserción de epítopos del virus de la fiebre aftosa en las VLPs de RHDV
Epítopos B, Sitio A (respuesta inmune humoral)
Epítopos T (respuesta inmune celular)
accgccagtgcacgcggggatttggctcacctaacga
T A S A R G D L A H L T
VLPs
Si
Si
Si
Si
Si
Si
No
Inserciones en el extremo carboxi terminal

13. Nuevas construcciones VLPs quiméricas
VP60
C-B
C-BT
NT-CB
B1
B2
B3
Epítopo B Epítopo T

14. Inmunogenicidad de VLPs de calicivirus en ratones
Inmunógeno:
PBS (control negativo)
VLPs RHDV: Lagovirus, transmisión aerógena.
VLPs NV: Norovirus, transmisión vía digestiva.
Vía de administración:
Intranasal
Intramuscular
Intraperitoneal
Dosis:
2µg
10µg
Variables examinadas:
60 ratones BALB/c de 5 semanas, hembras.
Grupos de 4 ratones.

15. Tiempo 20 dpi (sangría)
Tiempo 0 dpi (sangría preinmunes)
Tiempo 35 dpi (sangría)
1ra Inoculación
Sacrificio
Protocolo de Inmunización
2a Inoculación (boost)
Por cada vía de inoculación (intranasal, intramuscular e intraperitoneal):
PBS RHDV (2µg) RHDV (10µg) NV (10µg)NV (2µg)

16. 1
10
100
1.000
10.000
100.000
1.000.000
2 µg 10 µg 2 µg 10 µg
RHDV NV
Intranasal
1
10
100
1.000
10.000
100.000
1.000.000
Intramuscular
1
10
100
1.000
10.000
100.000
1.000.000
Intraperitoneal
2 µg 10 µg 2 µg 10 µg
RHDV NV
2 µg 10 µg 2 µg 10 µg
RHDV NV
4/4
1/4
1/4
1/4
3/4
4/44/4
4/44/4
4/4
4/4
4/4
TÍTULACION IgG EN SUERO

17. 10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
3.21%
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
3.8%
RHDV-VLPs
Mock
IFNγ
CD4+
CD8+
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0.31%
0.32%