Demostración de factores R en Bordetella Bronchiseptica aislado de cerdos.

1. Demostración de factores R en Bordetella Bronchiseptica aislado de cerdos.
Nobuyuki Terakado, Hayami Azechi, Kiyoji Ninomiya, and Takeshi Shinmizu.
Laboratorio nacional de ensayos veterinarios, Kokubunji, Tokio, Japón and el instituto
nacional de salud animal, Kodaira, Tokio, Japón.
Recibido para su publicación 9 de febrero de 1973
Se examinó la transferibilidad de la farmacorresistencia en cepas de Bordetella
bronchiseptica aisladas a partir de cerdos. Estas cepas fueron resistentes a la
sulfadimetoxina (SA, más de 1600 µg / ml), estreptomicina (SM, más de 800 µg / ml), y
aminobencil penicilina (APC, 200 µg / ml). Todos ellos podrían transferir su resistencia a los
fármacos como una unidad a una cepa sensible de Escherichia coli, así como a B.
bronchiseptica por cultivo mixto. La resistencia SM-SA-APC transferida en los
exconjugantes de E. coli y B.bronchiseptica también era transmisible por el cultivo mixto.
Pero la transferencia de triple resistencia no fue mediada por el filtrado libre de células de
la cepa de resistencia a fármacos de B. bronchiseptica que se utilizó como donante. Se
encontró que se elimina como un todo la triple resistencia en los exconjugantes E. coli
ML1410 mediante el tratamiento con acriflavina. De acuerdo con estos resultados, podría
concluirsede forma segura que los factores R portadores de resistenciaSM-SA-APC fueron
demostrados en cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos.
Bordetella bronchiseptica es un habitante frecuente del tracto respiratorio de diversos
animales y se creeque es un agente causal de la rinitis atrófica infecciosade cerdos jóvenes
(8,9). Muchos antibióticos y quimioterápicos de origen sintético han sido ampliamente
utilizados para su control. Un informe reciente (2), no obstante, indica que muchos
aislamientos de B. bronchiseptica se han convertido resistentes a la sulfonamida.
Recientemente hemos aislado de las cavidades nasales de los cerdos jóvenes cepas de B.
bronchisetica que eran resistentes no sólo a sulfadimetoxina (SA), sino también a la
estreptomicina (SM) y aminobencil penicilina (APC). A partir del patrón de estas cepas
resistentes, se sospechó que su resistencia podría ser mediada por factores transferibles
de resistencia a los fármacos (factores R) (5). Este artículo trata de la demostración de los
factores R en cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas bacterianas.
Siete cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos fueron utilizadas como
donadoras de resistencia a fármacos. B. bronchiseptica ATCC 4617 se utilizó como control.
Subcepas de Escherichia coli K-12 se utilizaron como células receptoras de resistencia al
fármaco; ML1410 , F-
met-
(requiere metionina) nal+
(resistente al ácido nalidíxico), ML1410
- RFP, F-
met-
nal+
rft +
(resistente a la Rifampicina), W3630 , F-
mal-
(no fermentadores de
maltosa). Los subcepas de K-12 fueron suministrados por S. Mitsuhashi. B. bronchiseptica
114, una mutante resistente a ácido nalidíxico (NA) obtenida mediante la difusión en una
placa de agar nutritivo que contiene 200µg/mL de NA también fue utilizó como receptora.
(Para sensibilidad a los fármacos de estas cepas, véase el cuadro 1.)

2. Medios.
 Caldo Penassay (Difco es la marca) se utilizó como un medio líquido.
 Agar infusión de corazón (Difco).
 Medio Mueller-Hinton (Difco).
 Agar DHL (Eiken Química Co., Tokio).
 Agar nutritivo (10g de peptona, 5g de NaCl y
15g de agar en 1000 mL de caldo de infusión
carne de caballo (pH 7,5).
 Agar AL (1000mL de medio A (1), 20g de lactosa,
40mL de azul de bromotimol 0,2 %, y 13g de agar).
La metionina se añade a una concentración de 50 µg / ml cuando sea necesario.
Drogas.
Se utilizó SA , SM, APC , rifampicina (RFP ) , tetraciclina ( TC ) , cloranfenicol (CP ) ,
kanamicina ( KM ) y gentamicina (GM ). RFP y GM fueron un regalo de Y. Yagisawa,
Asociación de Investigación de Antibióticos de Japón. SA fue suministrada por Industrias
farmacéuticas Takeda, Ltd., Osaka; y NA por Daiichi Seiyaku Co., Ltd. de Tokio. Otros
antibióticos fueron estándares de trabajo en nuestro laboratorio.
Prueba de sensibilidad a los fármacos.
Se utilizó el método de dilución de agar para la determinación de sensibilidad al fármaco.
Una asada de una dilución 10-2
de un cultivo que se dejó incubando durante toda la noche
fue cultivada en una caja con agar de infusión de corazón que contenía diluciones seriadas
(en las que se fue duplicando la dilución) de cada fármaco. Para el ensayo de resistencia a
SA, se utilizó medio Mueller- Hinton. La concentración mínima inhibidora de cada fármaco
se leyó después de incubar a 37 ° C durante 18 hr.
La transferencia de resistencia a medicamentos.
La transferencia de resistencia a los fármacos en B. bronchiseptica se examinó mediante
una modificación del método informado anteriormente. Volúmenes iguales (5 mL) de
cultivos agitados durante toda la noche de cepas donadoras y receptoras, de densidad
celular de aproximadamente 109/ mL, se mezclaron y se incubaron a 37 ° C sin agitación.
Después de 1 h de incubación, se sembró en medios selectivos una dilución apropiada de
la mezcla.
Cuando se utilizó ML1410 como célula receptora de resistencia al fármaco, se ocupó una
placa de agar DHL contiene tanto NA (50µg/mL) y SM (12,5 µg /mL) para la selección de la
exconjugante ML1410. Cuando se utilizó B. bronchiseptica 114 como célula receptora, se
utilizó una placa de agar nutritivo que contiene tanto NA (200µg/mL) y SM (400µg/mL).
El número de células viables de E. coli y B. bronchiseptica se determinó mediante un
método de dilución en agar después de 24 y 48 h de incubación a 37 ° C, respectivamente.
El número de células viables de E. coli y B. bronchiseptica se determinó mediante un
método de dilución en agar después de 24 y 48 h de incubación a 37°C, respectivamente.
La frecuencia de la transferencia siempre se calculó en relación con el número de donantes
(es decir, la transferencia por célula donante). Alrededor de 10 colonias que se
Utilizados como
medio sólido.

3. desarrollaron en la placa selectiva, se escogieron al azar en cada caso y se purificó en la
misma placa. Después de lo anterior la transmisión de su resistencia se examinó más a
fondo mediante un cultivo mixto, ya sea con W3630 ó ML1410-RFP. Cuando se utilizó
W3630 como receptora, se utilizó una placa de agar AL libre de metionina que contiene
12.5µg/mL de SM. Cuando ML1410-RFP fue usado como receptor, se utilizó una placa de
agar DHL que contiene tanto RFP (50 µg / ml) y SM (12,5 µg / ml).
Preparación de los cultivos filtrados.
Para confirmar la transmisión conjugativa de resistencia a los fármacos B. bronchiseptica,
los filtrados de cultivo se preparan a través filtros de membrana de 0,45µm (Millipore Co.,
Bedford, Mass .: (i) un filtrado de un cultivo de toda una noche de B. bronchiseptica de 0-
16 y (ii) un filtrado de cultivo-irradiado de ultravioleta (UV) 0-16). El filtrado de cultivo-
irradiado con una dosis de UV con una lámpara UV (ultravioleta Products,Inc., San Gabriel,
California.) dio aproximadamente 0,1 % de supervivientes.
Tratamiento con acriflavina.
El exconjugante ML1410 R+
te16, que adquirió resistencia a los fármacos a partir de B.
bronchioseptica de 0-16, se utilizó como una cepa resistente. El tratamiento con clorhidrato
de acriflavina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka) se realizó esencialmente por un
método igual que el de Mitsuhashi et al. (6), y Watanabe y Fukasawa (12). Las células
sensibles, que habían perdido sus marcadores de resistencia,fueron detectadas por réplica
en placa (4). Todas las colonias que se desarrollaron en la placa principal, pero no crecieron
en la placa de réplica fueron escogidas, y se examinó la resistencia a los fármacos.
RESULTADOS
Resistencia a fármacos en B. bronchiseptica.
Sesenta cepas de B. bronchiseptica se aislaron de las cavidades nasales de cerdos jóvenes
criados en granjas de cerdos en varios distritos de Japón, y se examinó su resistencia a los
agentes antimicrobianos. De sesenta cepas analizadas, siete resultaron ser altamente
resistente a la SA, SM, y APC, pero aún sensibles a NA, RFP, TC, CP, KM y GM. La
resistencia a los fármacos de estas cepas se muestra en la Tabla 1.
Transferencia conjugativa de la resistencia en B. bronchiseptica.
Siete cepas de B. bronchiseptica aisladas a partir de cerdos fueron utilizadas como
donadoras de resistencia a fármacos en cultivo mixto. Como se muestra en la Tabla 2, la
resistencia a SM-SA-APC fue transferida como un todo para ML1410 a una frecuencia de
aproximadamente 1O-7
a 10-8
por célula donante. Cabe señalar que los niveles de
resistencia a la SM y APC se redujeron en el exconjugante ML1410 en comparación con la
de la cepa donante. Del mismo modo, la resistencia SM-SA-APC en siete cepas de B.
bronchiseptica se transfirió conjugativamente a una cepa sensible a los fármacos de B.
bronchiseptica 114 a una frecuencia de 10-4
a 10-6
. En este caso, los niveles de SM y APC
en los exconjugantes de B. bronchiseptica 114 fueron los mismos que los de las donadoras
(Tabla 3). Además, se encontró que la resistencia a SM-SA-APC transferida en la

4. exconjugante ML1410 podría ser transferido por un cultivo mixto a cualquiera de W3630 o
ML1410-RFP. Del mismo modo, se encontró que la triple resistencia en el exconjugante B.
bronchiseptica 114 era transmisible mediante cultivo mixto a ML1410-RFP. Por otro lado,
la transmisión de la resistencia a SM-SA-APC no se demostró cuando se utilizó el filtrado
libre de células de una cepa resistente de B. bronchiseptica de 0-16, cuya resistencia era
transmisible mediante cultivo mixto, como donante.
Eliminación de la resistencia a los fármacos.
Para confirmar el hecho de que la resistencia a los fármacos transmisible en B.
bronchiseptica fue mediada por factores R, la exconjugante ML1410 resistente a SM- SA-
APC se trató con acriflavina. Las muestras a ser tratadas con acriflavina, fueron divididas
en dos grupos; una fue irradiada con una lámpara de UV antes del tratamiento con
acriflavina y el otra no se irradió. Como se muestra en la Tabla 4, la resistencia a SM-SA-
APC podría ser eliminada a una frecuencia desde 13 hasta el 21% por tratamiento con
5.0µg/Ml del fármaco. Como se muestra en la Tabla 4, la resistencia a SM-SA-APC podría
ser eliminada a una frecuencia desde 13 hasta el 21% por tratamiento con 5.0µg/Ml del
fármaco. No se detectó ninguna segregación del patrón de resistencia.
DISCUSIÓN
Desde el descubrimiento de factores transferibles de resistencia a fármacos (factores R) en
Japón (5), los estudios epidemiológicos y genéticos sobre los factores R han sido llevadas
a cabo por muchos trabajadores en diferentes partes del mundo. La transferencia de la
resistencia a los fármacos mediado por factores R incluye muchos fármacos útiles contra
las infecciones bacterianas. En consecuencia,un aumento de la prevalencia de los factores
R en bacterias de origen animal es un grave problema no sólo para la higiene de los
animales sino también para la salud pública. El presente trabajo muestra que la triple
resistencia a SM-SA-APC de B. bronchiseptica puede transferirse como una unidad a una
cepa sensible de E. coli, así como a B. bronchiseptica por cultivo mixto. Pero la transmisión
de triple resistenciaen B. bronchiseptica no pudo demostrarsemediante el filtrado de cultivo
de B. bronchiseptica de 0-16, cuya resistencia era transferible por el cultivo mixto. La
resistencia a SM-SA-APC en el exconjugante ML1410, cuya resistencia fue trasferida por
el cultivo mixto de B. bronchiseptica 0-16, fue eliminado por el tratamiento con acriflavina.
De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que la resistencia a SM-SA-APC en B.
bronchiseptica fue mediada por factores R. Informaron Watanabe y Fukasawa (11) que los
niveles de resistencia SM de los factores R que se originaron a partir de Shigella,
disminuyen notablemente cuando se introduce en una cepa de E. coli K-12. Se encontró en
el presente estudio que el nivel de resistencia a SM es muy alto en B. bronchiseptica, pero
baja en E. coli cuando se transfiere. La razón de esto es desconocida. Las tetraciclinas son
ampliamente utilizadas en la cría de animales y la medicina veterinaria, en consecuencia,
los factores R que llevan la resistencia a TC pueden demostrarse en alta frecuencia de
bacterias entéricas aisladas de ganado en Japón (3, 7). Por el contrario, las cepas TC-
resistentes de B. bronchiseptica no se han aislado hasta el momento. Por el contrario, las

5. cepas resistentes a PCA de B. bronchiseptica se aíslan a una frecuencia considerable,
aunque el fármaco no se ha utilizado ampliamente en la medicina veterinaria en Japón.
Estas discrepancias pueden requerir más estudios epidemiológicos y genéticos de
resistencia en bacterias aisladas de ganado. Los estudios genéticos de factores R
procedentes de B. bronchiseptica se encuentran ahora en progreso y se describen en otra
parte.
TABLA 1. SENSIBILIDAD A LOS FÁRMACOS DE LAS CEPAS UTILIZADAS.
a
Concentración inhibidora mínima de cada fármaco se determinó por el método de
dilución en agar.
TABLA 2. TRANSFERENCIADE RESISTENCIAA LOS FARMACOS DE Bordetella
bronchiseptica a Escherichia coli ML1410 POR CULTIVO MIXTO.
a.
Cultivo mixto hecho por el método descrito en Materiales y Métodos.
b.
Frecuencia de transferencia se calcula como el número de beneficiarios
exconjugantes, que adquieren resistencia a los medicamentos, dividido por el de las
células del donante.
c.
La Concentración Mínima Inhibitoria de 10 colonias examinadas, se encontró que
era la misma. Medido en µg/mL.

6. TABLA 3. TRANSFERENCIADE RESISTENCIAA LOSMEDICAMENTOSDE Bordetella
bronchiseptica a B. bronchiseptica 114 POR CULTIVO MIXTO.
a. b. c.
Véase la nota correspondiente a la Tabla 2.
TABLA 4. ELIMINACIÓN DE LA RESISTENCIAA LOS MEDICAMENTOS MEDIANTE
EL TRATAMIENTO CON ACRIFLAVINA.
a. Se utilizó E. coli ML1410 que había adquirido resistencia a los fármacos por el cultivo mixto con B.
bronchiseptica 0-16.