PRIMER SEMINARIO INTERNACIONAL DE LA TRUCHA 2015 PUNO - PERÚ

1. Abordaje terapéutico global para
patologías en la experiencia de la
acuicultura chilena.

2. Antecedentes
• Durante la fase de agua dulce, bacterias como Flavobacterium spp. y otras entre
las que se destaca Renibacterium salmoninarum (causante del BKD) son factores
que de una u otra forma además de causar una no menor mortalidad,
• BKD es una enfermedad la que se presenta en agua dulce y que existe en Chile
desde los inicios de la Industria Salmonera Nacional hacia la década del 80, de ahí
en adelante esta ha sido controlada mediante el uso de Antibióticos frente a brotes
con diagnóstico y antibiograma positivo y mediante el control de la transmisión
vertical (Reproductores/Ovas) mediante la eliminación de positivos mediante
Screening a los lotes de desove.

3. • El daño a nivel renal causado por Renibacterium salmoninarum que afecta la calidad
del alevín a trasladar y reduciendo el impacto que estados inmunitarios deprimidos
puedan facilitar el ataque de otras patologías como IPNv y otras entidades
emergentes que pudieran provocar en un futuro, reduciendo además el uso de
antibióticos en la industria.
• La caracterización de los aislados es fundamental para determinar si existen
diferencias o similitudes entre ellos a nivel bioquímico, genético, antigénico y
serológico.
• Además de determinar virulencia de los aislados. Para esto se realizan diferentes
técnicas moleculares de tipificación y serotipificación, como también desafíos en
peces en condiciones controladas.

4. Diagnóstico primario

5. Levantamiento de información
Desafíos
• Busqueda de aislados
• Metodos de cultivo
• Reproducibilidad del cuadro
• Expresiones no deseadas (p57)
(IX, X, XI, XII y XIV regiones de Chile)

6. Aislamiento y cultivo exitoso de R. salmonimarum
Medios solidos KDMC y KDM–2, 13 aislados nacionales de R. salmoninarum obtenidos del
levantamiento en campo (IX, X, XI, XII y XIV regiones de Chile).
Aislados de la bacteria que hoy en día se encuentran activos y asociados a brotes en las
producciones de salmones en Chile.

7. Cocos y diplococos en algunos casos, Gram positivos, oxidasa y catalasa positivos. Es un
microorganismo de fastidioso crecimiento ya que tarda en crecer entre 15 a 21 días en
placas de KDM–C o KDM–2 incubadas a 15ºC.
Transcurrido ese período de incubación, en las placas se pueden observar colonias blancas
y redondas de entre 1 a 3 mm de diámetro.
. Frotis 1000X de un aislado nacional del patógeno de peces R. salmoninarum. En la imagen se pueden apreciar abundantes cocos
Gram positivos. B. Imagen de las colonias de un aislado nacional del patógeno de peces R. salmoninarum, colonias puntiformes,
redondas y blancas.

8. Cepa Huésped Origen (Región de Chile) Año Fase Tipo de agua
ATCC 33209T Oncorhynchus tshawytscha Leaburg Hatchery, Oregon 1980 Hatchery Dulce
BV 911–009 PA Oncorhychus kisutch Ensenada baja, Chacabuco (XI) 2009 Engorda Mar
BV 912–013 PA Oncorhychus kisutch Ensenada baja, Chacabuco (XI) 2009 Engorda Mar
BV 0083–1109 PA Oncorhychus kisutch Pto. Aysén (XI) 2009 Engorda Mar
RsSS–10 PM Oncorhychus kisutch Estero del Reloncaví (X) 2010 Engorda Mar
BV 48379 PM Oncorhychus kisutch s/i 2011 Smolt s/i
RsSS–12 PM Oncorhychus kisutch Estero del Reloncaví (X) 2012 Engorda Mar
BV 49950 PM Oncorhychus mykiss Niebla (XIV) 2012 Alevinaje Dulce
BV 810–008 PA Salmo salar Fiordo Aysén, Bahía Acantilada (XI) 2008 Engorda Mar
BV 910–008 PA Salmo salar Pto. Aysén (XI) 2008 Engorda Mar
BV 1104–033 PA Salmo salar XI región (barrio 26B) 2011 Engorda Mar
RsSME–12 HP Salmo salar Hornopirén (X) 2012 Engorda Mar
BV 49923 PM Salmo salar Conguillío (IX) 2012 Alevinaje Dulce
BV 50157 PA Salmo salar Seno Aracena (XII) 2012 Engorda Mar
Colección (cepario) VQ R. salmonimarum

9. • Crecimiento bacteriano de los 13 aislados de campo del patógeno en los dos
medios de cultivo recomendados en la literatura para el crecimiento del
agente, después de 21–24 días a 15°C.
• Está reportado en la literatura que R. salmoninarum es un organismo de
fastidioso crecimiento, motivo por el cual su crecimiento demora entre 18 a 25
días.
• Generacion de crioviales de cada uno de los aislados y cepa de referencia de R.
salmoninarum ATCC 33209T, los cuales se conservan a –80°C.
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.

10. Elisa, Kit comercial
PCR anidado especie–específico de acuerdo al protocolo de Pascho et al., (1998), fragmento
de 320pb.
Identificación de los aislados por Elisa y PCR especie–específico.
Figura 1. Resultados del PCR anidado especie–específico para la detección del patógeno de peces Renibacterium salmoninarum de acuerdo al protocolo de Pascho et
al., (1998). C+, Control positivo ATCC 33209T; C–, Control negativo; M, estándar de peso molecular de 100pb. 1–13 aislados chilenos de R. salmoninarum.

11. Caracterización bioquímica, métodos convencionales y sistemas
miniaturizados api® ZYM.

12. Susceptibilidad a agentes antimicrobianos.
Aislado/Halo (Ømm) FFC AML E SXT ENR OA UB TE OT
ATCC 33209T
27 R 28 R 51 R 28 96 50
BV 911–009 PA 33 42 R 32 R R 23 86 91
BV 912–013 PA 35 41 R 33 R R 25 84 92
BV 0083–1109 PA 39 41 5 42 R R 12 96 100
RsSS–10 PM R 19 13 R 22 R 22 R R
BV 48379 PM 41 25 43 R 50 R 18 60 52
RsSS–12 PM 30 R 50 R 44 R 31 42 R
BV 49950 PM 28 48 52 R 50 R 36 52 62
BV 810–008 PA 42 42 15 21 R R 23 81 82
BV 910–008 PA 42 42 15 21 R R 23 80 83
BV 1104–033 PA 32 31 15 42 12 R 13 98 120
RsSME–12 HP 32 32 53 R 44 R 29 66 36
BV 49923 PM 27 23 52 R 40 R 35 34 54
BV 50157 PA 29 32 55 R 66 R 41 87 90

13. • Los patrones de susceptibilidad de los 13 aislados chilenos a los
antimicrobianos estudiados, indican que todos los aislados son resistentes
al ácido oxolínico.
• 7 de los 13 de los aislados (3 de salmón coho, 1 de trucha y 3 de salmón
del Atlántico) son resistentes al SXT al igual que la cepa de referencia y 5
aislados resultaron resistentes al ENR (3 de salmón Coho y 2 de Atlántico).
Antibióticos

14. • Se logró aislar y cultivar en medio solidos KDMC y KDM–2 los aislados
nacionales de R. salmoninarum.
• Se generaron 3 viales de cada uno de los aislados del patógeno.
• Se comprobó que los 13 aislados corresponden al patógeno de peces R.
salmoninarum mediante dos protocolos de PCR.
• Los 13 aislados bioquímicamente constituyen un grupo homogéneo y
además presentan el mismo perfil que la cepa de referencia utilizando los
sistemas miniaturizados api® ZYM.
• Los 13 aislados son resistentes al ácido oxolínico. Además se observaron 9
aislados resistentes al sulfamida potenciada, 5 aislados resistentes al
enrofloxacino.
Conclusiones.

15. Análisis filogenético de una región del ARN 16S de Renibacterium salmoninarum
( 1445 pb del gen)

16. Determinación de patogenicidad en peces.
Inoculación mediante émbolo oral, utilizando alimento mezclado con inoculo bacteriano
ajustado, a peces previamente sedados.

17. Ensayo vía inmersión, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada cepas RsSS–10
PM (amarillo) y BV 1104–033 PA (verde).
Desafío inmersión.

18. Primer ensayo desafío oral (émbolo).
Ensayo vía oral, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada para el primer ensayo oral (E) cepas
RsSS–10 PM (amarillo) y BV 1104–033 PA (verde).

19. Desafío intraperitoneal (IP).
Ensayo vía IP, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada cepas RsSS–10 PM (amarillo) y
BV 1104–033 PA (verde).

20. Ensayo vía IM, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada cepas RsSS–10 PM (amarillo)
y BV 1104–033 PA (verde).
Desafío intramuscular (IM).

21. Se logró reproducir en condiciones experimentales de acuario, el cuadro clínico de
la enfermedad bacteriana del riñón (BKD, por su sigla en inglés) utilizando truchas
arcoíris como modelo animal con las cepas RsSS–10 PM, BV 1104–033 PA y BV
49950 PM.
Independiente de la vía de inoculación utilizada se pudieron observar las cuatro
etapas de la enfermedad propuestas por Nance et al., 2010, durante una infección
por Renibacterium salmoninarum a medida que trascurría el desafío.
Se observa un efecto dosis dependiente entre la concentración del inóculo y el
porcentaje de mortalidad acumulada, especialmente en el caso de los desafíos IP e
IM..
Se estableció como desafío la vía oral (émbolo) a través del alimento como
metodología para la evaluación de vacunas en condiciones experimentales y con
una duración del desafío de no menos de 60 días.
Conclusiones

22. Determinación de cinética de inactivación
Cinética de inactivación del cultivo bacteriano titulado de la cepa RsSS–10 PM.

23. Hitos.
Aislamiento y cultivo exitoso de R. salmonimarum.
Generación de cepario caracterizado de R. salmoninarum.
Caracterización de perfiles proteicos y análisis serológico de los aislados de R.
salmoninarum.
Estudio de infectividad y patogenicidad de los aislados de R.salmoninarum:
De acuerdo a las técnica de PCR especie específico, se comprobó que los 13 aislados
de campo de la colección, corresponden al patógeno de peces R. salmoninarum.
Se comprobó que los 13, bioquímicamente constituyen un grupo homogéneo y
además presentan el mismo perfil que la cepa de referencia utilizando los sistemas
miniaturizados api® ZYM.
Realizados los estudios de susceptibilidad antibiótica, se observa que los 13
aislados son resistentes al ácido oxolínico. Además se observaron 9 aislados
resistentes a sulfamida potenciada y 5 aislados resistentes a enrofloxacino.

24. . Vacunación por inmersión (alevinaje)
. Vacunación oral (alevinaje).
. Vacunación Inyectable un antígeno.
. Vacunación Inyectable poli antigénicas.
Vacunas disponibles en Chile

25. Enfrentando los problemas.
• Atrasar hasta donde se pueda, el contacto del agente con los peces
• Vacunación: Oral (baños) + vacunas inyectables
• Bioseguridad: Agua Dulce
• Manejo del Stress
• Temperatura:
– Implementar alternativas de subir temperatura (recirculación re uso)
• Genética:
– Parte de la variabilidad en la mortalidad para patógenos, está
determinada genéticamente (estudios serios)

26. Gracias por su atención.