Este documento describe los procedimientos para obtener cultivos puros de microorganismos a partir de una muestra mixta. Incluye instrucciones para preparar placas de aislamiento, diseminar la muestra en las placas, incubar y observar el crecimiento de colonias, estudiar la morfología de las colonias, realizar un transplante a tubos con agar nutritivo para obtener un cultivo puro, e instrucciones para usar bolsas anaeróbicas Gaspak® para cultivar microorganismos anaerobios. El objetivo es que los

1. • Introducción
Trabajo Práctico Nº 4
• Objetivo
OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
• Fundamento
• Procedimiento
• Resultados
• Instrucciones para el
uso del Sistema
Anaeróbico Gaspak®
• Bibliografía
INTRODUCCIÓN
En los ambientes naturales los microorganismos se
encuentran usualmente como poblaciones mixtas,
pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identi-
ficarlos, necesitamos tenerlos como cultivos puros.
Un cultivo puro es aquel en el que todos los microor-
ganismos provienen de una sola célula.
La obtención de un cultivo puro, a partir de una po-
blación mixta, se lleva a cabo en dos etapas:
1. La muestra debe diseminarse de manera tal que
los diferentes microorganismos queden lo sufi-
cientemente separados sobre la superficie de un
medio de cultivo sólido, de manera que luego de
la incubación ellos formen colonias visibles aisla-
das. Este proceso se conoce como aislamiento.
En esta placa tendremos diferentes tipos de colo-
nias correspondientes a los diferentes microorga-
nismos presentes en la población original.

2. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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2. Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento
a un tubo que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada;
este procedimiento se conoce como transplante.
Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo
de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará
que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las co-
lonias obtenidas presenten las mismas características.
El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros
factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espe-
ra aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus características y/o por
la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del mi-
croorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, se deben utilizar medios
de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes
contaminantes.
La temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los microorga-
nismos, usualmente la temperatura óptima de los microorganismos patógenos pa-
ra el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el microorganismo que se intenta ais-
lar es anaeróbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la
presencia de oxígeno en el ambiente donde se desarrollará el mismo.
Basándose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles
microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento
ayudará en la selección del medio y las condiciones de cultivo adecuadas. Para
iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de los síntomas de la enferme-
dad que padece la persona de quien se obtuvo la muestra analizada.
OBJETIVO
Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de:
Ejecutar las técnicas básicas para el aislamiento de microorganismos en cultivo
puro, a partir de una muestra que contiene una población mixta.
FUNDAMENTO
Al diseminar sobre un medio de cultivo sólido una muestra de bacterias, diluida
convenientemente, las células individuales quedarán lo suficientemente separadas
unas de otras y crecerán en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se
puede obtener un cultivo puro.
4.2

3. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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PROCEDIMIENTO
Preparación de las placas de aislamiento
(Cada estudiante preparará dos placas)
1. Marcar la tapa de cada placa estéril con su número de equipo y la fecha.
2. Fundir en un baño de agua hirviendo los tubos con 20 mL de agar nutritivo1,
luego de que estén completamente fundidos, colocar en un baño de agua a
50°C.
3. Tomar el tubo con los 20 mL de agar fundido y enfriado a 50°C, secarlo bien
por fuera, flamear la boca del tubo y verter en la placa de Petri.
4. Después de verter el medio, si es necesario, rotar la placa cuidadosamente
para distribuir el agar en forma homogénea, teniendo cuidado de no salpicar la
tapa.
5. Dejar solidificar, lo cual ocurre en aproximadamente 10 minutos y proceder a
secar las placas abiertas y en posición invertida en la estufa.
1
Con fines didácticos y por razones de índole económica, las muestras suministradas a los alumnos han sido
contaminadas con gérmenes que se desarrollan bien en agar nutritivo, por tal motivo, éste será el medio de
cultivo que utilizarán para el trabajo de aislamiento. Sin embargo, debe recordarse que, el o los medios de
cultivo a utilizar para el aislamiento, se seleccionarán basándose en los requerimientos de los microorganis-
mos más frecuentemente encontrados en la muestra analizada.
4.3

4. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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Aislamiento
1. Tomar una gota de la suspensión microbiana con el asa de platino estéril y fría,
y colocarla sobre el agar en el sitio marcado con una X en la figura siguiente.
X
2. Diseminar la muestra haciendo estrías con el asa sobre el agar en la dirección
indicada en la figura siguiente.
X
3. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estrías en dirección
perpendicular a las estrías anteriores como se indica en la figura siguiente.
X
4. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estrías en dirección
perpendicular a las estrías anteriores como se indica en la figura siguiente.
4.4

5. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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X
5. Incubar una de las placas en posición invertida y en condiciones aeróbicas a
32,5 +/- 2,5ºC por 24 h.
6. Introducir la otra placa en posición invertida en una jarra para cultivo de anae-
robios (sistema Gaspak® e incubar a 32,5 +/- 2,5ºC por 24h, siguiendo las ins-
trucciones para el uso de las jarras que se suministran en la página 3.8).
7. Observar el crecimiento obtenido en las placas.
RESULTADOS
Anotar lo observado
Dibujar lo observado
Estudio de la morfología de la colonia
Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo sólidos, las célu-
las aisladas se multiplican sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conoci-
do con el nombre de colonia, las características de estas colonias son estudiadas
y se usan en la identificación de las especies.
4.5

6. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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Las características que se le estudian a las colonias son:
Tamaño Elevación
Pigmentación Apariencia general
Forma Superficie
Borde
Forma de las colonias
ENTERO ONDULADO LOBULADO
EROSIONADO RAMIFICADO RIZADO
Borde de las colonias
PLANA ELEVADA CONVEXA
PULVINADA UMBILICADA
Elevación de las colonias
Elevación de las colonias
4.6

7. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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Observar a simple vista y con la ayuda de la lupa, las colonias de las placas que le
suministre el profesor, para determinar las características de las mismas.
RESULTADOS
Anotar lo observado
Dibujar lo observado
Transplante
1. Usando el filamento, trasplantar a un tubo con agar nutritivo inclinado, la colo-
nia que le indicó el profesor, de la que ya anotó las características de acuerdo
con lo indicado en el aparte anterior.
4.7

8. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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2. Incubar a 32,5 +/- 2,5ºC por 24 horas.
RESULTADOS
Anotar lo observado
Dibujar lo observado
INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL SISTEMA ANAERÓBICO GASPAK®
1. Colocar las placas o los tubos en la jarra Gaspak®.
2. Tomar un sobre indicador anaeróbico, abrirlo hasta la mitad y colocarlo como
se indica en la figura siguiente, de manera que la tira de papel sea visible des-
de el exterior de la jarra. En condiciones anaeróbicas, el indicador se mantiene
incoloro, en condiciones aeróbicas se torna azul.
3. Cortar la esquina de un sobre generador de Hidrógeno + CO2 Gaspak® y colo-
carlo en la jarra como indica la figura siguiente.
4.8

9. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
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4. Medir con una pipeta 10 mL de agua en el sobre, por el extremo abierto. No
introducir la pipeta o algún otro objeto en el interior del sobre.
5. Colocar la tapa de la jarra, luego la pinza y asegurarla con el tornillo apretándo-
lo a mano. No usar ninguna herramienta para apretar la tapa porque puede
dañarla. No usar grasa en el borde de la jarra, la empacadura proporciona un
sello efectivo.
6. Colocar el sistema Gaspak® en la estufa a 32,5 +/- 2,5ºC.
BIBLIOGRAFÍA
BBL Manual of products and laboratories procedures. 1973 Fifth edition. BBL divi-
sion of Beckton, Dickinson and Co.
Benson H. J. 1979. Microbiological Application. A Laboratory Manual in General
Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers. Dubuque, Iowa
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Ge-
nerales. Segunda edición. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezue-
la.
Seeley, H.W.I, Jr and P.J. Van Demark. 1972. Microbes in action. W.H. Freeman
and Company.
Prof. Magaly Pedrique de Aulacio
Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa
Noviembre 2001
Revisión 2008
4.9