TEST PRENATAL NO INVASIVO

1. NIPT: cffDNA
Test Prenatal No Invasivo
Andres Jose Ricaurte S, MD FACOG
Hospital Universitario Departamental de Nariño ESE

2. Declaración de conflictos de interés
• Ninguno

3. Un poco de historia…
• 1959: Dr Jerome Lejeune, estableció la relacion
entre trisomía 21 y Sd Down.
• Fue la primera vez que una entidad clínica se
relacionaba con una anormalidad cromosómica.
• 1960: Trisomía 18 (Sd Edwards) y la 13 (Sd Patau)
• Desde esa época muchas aberraciones numéricas
cromosómicas han sido establecidas

4. En humanos:
• 10-30% de los óvulos fertilizados tienen un #
incorrecto de cromosomas(aneuploidía)
• 1/3 de todos los abortos presentan una
aneuploidía
• 1 / 300 nacidos vivos presenta una aneuploidía
• Las aneuploidías son la causa genética numero
1 de abortos y defectos congénitos

5. Conceptos
• cffDNA: Fracción libre fetal de DNA en sangre
materna provenientes de la placenta
• Nucleotido:
• DNA templado:

6. Factores de riesgo para aneuploidías
(ACOG 2015)
Edad materna de 35 a mas años
Hallazgos en US que indiquen riesgo de
aneuploidía
Historia de un feto o hijo con trisomía
Cualquier test previo positivo para aneuploidía
Translocación Robertsoniana balanceada
parental con incremento de T13 o T21

7. Riesgo de Trisomía 21

8. SONOGRAMA GENETICO
Fémur corto, Húmero corto, hipoplasia o
ausencia de hueso nasal, acortamiento del
quinto dedo de la mano, y también del
segundo, presencia de un foco ecogenico
intracardiaco, presencia de ventriculomegalia,
dilatación de la pelvis renal, etc.,etc.

9. SENSIBILIDAD FALSOS POSITIVOS
CRIBADO POR EDAD
(70s)
+ 35 A. 30% 7.5-14%
DOBLE TEST AFP + hCG 55-60% 5%
TRIPLE TEST AFP+hCG+uE3 60-65% 5%
CUADRUPLE TEST AFP+hCG+uE3+inhA 70-75% 5%
SONOGRAMA
GENETICO
Alteraciones
estructurales
65-75% 5%
CRIBADO
BIOQUIMICO (1er
TRIM)
hCG+PAPP-A
*En T21 la hCG se
duplica y la PAPPA
disminuye a la mitad
65% 5%
TR. NUCAL Medición TN 75% 5%
TEST COMBINADO hCG+PAPP-A+TN 86% 3%
INTEGRADO TN+PAPP-A
+CUADRUPLE TEST
96% 5%
ACOG 2015 - Nicolaides, 1990 – Krants 1996 – SURUSS Study 2003

10. Translucencia nucal (TN) & Hueso nasal – CRL 45-
84 MM

14. TN & Alteraciones cromosomicas
Human Reprod 2008;23:1968-1975

15. Marcadores BQ & Aneuploidías

16. Marcadores bioquimicos & T21
Prenat diagnosis 2011;31:1077-1081

19. Hueso nasal + TN disminuye Falsos +

20. Marcadores ecográficos 2do trimestre
de Trisomía 21

21. Aberrant right subclavian artery: incidence and correlation with other markers of Down
syndrome in second‐trimester fetuses
Ultrasound in Obstetrics & Gynecology
Volume 39, Issue 2, pages 191-195, 25 JAN 2012 DOI: 10.1002/uog.10053
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/uog.10053/full#fig2

23. Avances en estudios genéticos
Tecnica
de Banda
(1970)
FISH (1990)
Arrays
(2002)
cfDNA
(2011)
Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am. 1990; 262: 56-61.
Klinger K., Landes G., Shook D., Harvey R., Lopez L., Locke P., Lerner T., Osathanondh R., Leverone B., Houseal T. (1992). Rapid detection of
chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using flourescence in situ hybridization. Am. J. Hum. Genet., 51:55-65.

24. FISH: en que consiste?
• FISH es una tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas con un
fluoróforo para detectar o confirmar anomalías génicas o
cromosómicas que generalmente están más allá de la capacidad de
resolución de la citogenética de rutina.
• FASES:DNA (cromosomas metafásicos o núcleos en interfase)
se desnaturaliza, proceso que separa las hebras complementarias
de la estructura bicatenaria en doble hélice del DNA. A la muestra
desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés, que se
asociará al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso
denominado hibridación, donde se vuelve a formar una doble
hélice. La sonda está unida covalentemente (marcada) con un
fluoróforo, que emite una señal observable mediante un
microscopio de fluorescencia; así la muestra de DNA se puede
clasificar según la presencia o ausencia de la señal, lo que desvela la
presencia o ausencia de la secuencia diana en el DNA cromosómico.
Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic
aberrations of medical significance. Bishop R. Bioscience Horizons. 2010;3:85–95.

27. FISH: Que identifica?
• Aneuploidias
• Deleciones
• Síndrome del maullido (cri-du-chat)
• Síndrome de Kallman
• Síndrome de Miller-Dieker
• Síndrome de Williams
• Síndrome de Smith-Magenis
• Síndrome de Wolf-Hirschhorn
• Deficiencia de esteroide-sulfatasa
• Síndrome de Prader-Willi/Angelman
• Síndrome de DiGeorge, velocardiofacial (VCFS), CATCH 22 o
de Shprintzen
Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic
aberrations of medical significance. Bishop R. Bioscience Horizons. 2010;3:85–95.

28. NIPT
Test prenatal no invasivo

30. Cff DNA fetal

31. Disponibilidad Global de la NIPT
International Journal of Women’s Health 2015:7 113–126

32. NIPT
• Non Invasive Prenatal Test (2008)
• ACOG (2012): Tamizaje prenatal basado en DNA fetal
• Sabemos que el DNA fetal proviene del trofoblasto
placentario
• Tambien sabemos que en el plasma sanguineo de la
embarazada hay un promedio de 10% de DNA fetal
• Nuevo termino: Tamizaje del DNA libre (cffDNA test :
cell free fetal DNA test)
Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet
1997;350:485-7.
Chiu RW, Chan KC, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by
massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105

34. Objetivos de NIPT
NIPT
Reducir la
exposición del
feto al riesgo
Reducir los
falsos
positivos
Mejorar las
tasas de
detecciión de
aaneuploidias
Realizar un
test confiable
y de facil
realización

35. Indicaciones de NIPT
• Se puede realizar desde la semana 10 de
embarazo (embarazos 1 solo feto)
• Tamizaje de trisomías 21,18,13 en pacientes
de alto riesgo de aneuploidías
• Solicitud del paciente de conocimiento
temprano del sexo y del Rh
• Solicitud general del paciente previa
consejería detallada de beneficios,
limitaciones y alcances del test

36. Indicaciones
• Opción de tamizaje para mujeres con riesgo alto de
aneuploidías
• Mayores de 35 años
• Fetos con alteraciones estructurales en la ecografía
sospechosas de aneuploidías
• Mujeres con antecedentes de embarazos y fetos
afectados con trisomías
• Padres con Translocación Robertsoniana balanceada +
T13 o T21
• Paciente con resultados de Test de tamizaje de primero
o segundo trimestre positivos

37. Prevalencia de Aneuploidías comunes
53%
13%
5%
8%
5%
16%
T21
T18
T13
45X
TRISOMIA SEXUAL
OTRAS RARAS

38. NIPT cffDNA: Métodos de analisis
• Método WGS: Whole genome
sequencing(Secuenciación genómica completa), la
cual mide la presencia de DNA fetal libre respecto
del numero de cromosomas completos de la sangre
materna, evaluando si ciertos cromosomas tienen
mas o menos numero de “lecturas” consistentes con
aneuploidías
• Hasta ahora los meta-analisis han mostrado que
ambas técnicas son comparables en sus resultados
para aneuploidías com T21,T18,T13 y MX0

40. NIPT cffDNA: Métodos de análisis
• Método MPSS : Massive parallel signature sequencing (Secuenciación
masiva de la firma en paralelo)es un método para determinar los niveles
de expresión de ARNm contando el número de moléculas de ARNm
individuales producidas por cada gen.
• Una muestra de ARNm se convierte primero en ADN complementario
(ADNc) usando transcriptasa inversa, lo que facilita las manipulaciones
posteriores. Estos ADNc se fusionan a una "etiqueta" de oligonucleótido
pequeño que permite amplificar por PCR el ADNc y luego acoplarlo a
microperlas. Después de varias rondas de determinación de la secuencia,
usando hibridación de sondas marcadas fluorescentes, se determina una
firma de secuencia de ~16-20 pb a partir de cada perla. La imagen
fluorescente captura la señal de todas las cuentas, mientras que se fija a
una superficie bidimensional, por lo que las secuencias de ADN se
determinan a partir de todas las cuentas en paralelo. Existe cierta
amplificación del material de partida, por lo que, al final, se obtienen
aproximadamente 1,000,000 lecturas de secuencia por experimento.
Prenatal Diagnosis 2012, 32, 3–9

42. NIPT cffDNA: Métodos de analisis
• DANSR ™ (Digital Analyses of Selected
Regions): Análisis digital de regiones
seleccionadas que evalúa selectivamente
fragmentos genómicos específicos de cfDNA
• Utiliza oligonucleotidos selectivos que luego
son amplificados y secuenciados
• Realiza análisis selectivo de cffDNA,
proporcionando un uso más eficiente de la
secuencia para evaluar la aneuploidía fetal.
Prenatal Diagnosis 2012, 32, 3–9

45. NIPT cffDNA: Métodos de analisis
• Método SNP: Single Nucleotide Polymorphism(Polimorfismo
nucleotido simple), el cual mide la proporción relativa
materna y fetal de genotipos entre fragmentos del DNA libre
de celulas fetales, determinando si estos patrones o “lecturas”
son compatibles con expectativas disomicas o aneuploides

46. Cuadro comparativo

47. Cuales pruebas tenemos disponibles?
Verifi Prenatal
Test(Ilumina)
MaterniT21
Plus
Harmony
Prenatal Test
Panorama
Prenatal Screen

48. Que y como tamizan ?
COMO QUE
VERIFI
(Ilumina/Redwood City,CA)
Verinata Health
2012
US$ 1,500
WGS: Whole genome
sequencing(Secuenciación
genomica completa)
T13,T18,T21,Aneuploidias
Cromosomas sexuales,
Microdeleciones(Sd de
DiGeorge, Angelman,
Prader Willi, Wolf
Hirschhorn y Cri du chat)
MATERNI T21 PLUS
(Sequenom/ San Diego,CA)
2011
US$ 2,762
MPSS (Massively parallel
shotgun sequencing)
T13,T16,T18.T21.T22,Aneup
loidias de Cromosomas
sexuales, Sexo fetal,
Microdeleciones
HARMONY PRENATAL TEST
(Ariosa Diagnostics/San
Jose, CA) 2012 US$ 795
DANSR (Digital analysis of
selected regions)
Microarray method*
T21,T18,T13, Cromosomas
sexuales(por ej.MX0, XXY)
PANORAMA PRENATAL
TEST
(Natera/San Carlos, CA)
2012
US$ 1.495
SNP: Single Nucleotide
Polymorphism(Polimorfis
mo nucleotido simple),
T13,T16,T18.T21.Aneuploid
ias de Cromosomas
sexuales, Sexo fetal,
Microdeleciones

49. Confiabilidad de las diferentes técnicas
100.000
muestras
Incidencia T21
de 1:500
200 embarazadas con
fetos T21
Detectados
99.800 embarazos con fetos no
afectados
1:500 VERIFI > 199 < 0.1% Falsos
Positivos (FP)
0.1% Falla de la
prueba
1:500 MATERNIT21
PLUS
> 197 < 0.1% FP 1.3%
1:500 HARMONY > 194 < 0.1% FP 3%
1:500 PANORAMA > 192 < 0.1% FP 3.8%
1:500 TAMIZAJE
SERICO
> 188
5% FP
-----
NOTA: Los porcentajes de falla incluyen muestras rechazadas por baja fracción
fetal.
Ryan A et al, Fetal Diagn Ther. 2016 Mccullough RM et al, PLoS One 2014;9:e109173

50. Sensibilidad y Especificidad según la
técnica por aneuploidías
T21 T18 T13 45X0
TECNICA S E S E S E S E
Shotgun 99% 99% 99% 99% 87% 99% 92% 95%
Targeted 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99%
Megan A, Mollie AM et al, International Journal of Womens Health. 2015:7;113-126

51. Valor Predictivo Positivo
Vale la pena recordar que el Valor Predictivo Positivo de una prueba depende de:
-La condición que se estudia
-La sensibilidad y especificidad de la prueba
-La prevalencia de la condición en un grupo poblacional dado
-Del Riesgo a priori
-Edad de la paciente
-Por lo tanto estos VPP no pueden ser aplicados universalmente

52. Importancia de la Prevalencia de la
condición estudiada (ej. T21)

56. Implicaciones para la práctica clínica
VS

57. Fracción fetal y otras limitantes
• Usual: 10%
• Limitantes y causas de Fracción fetal baja: menor de 2,8%.
Algunos laboratorios piden que sea al menos 4%
• Edad materna: VPP en mayores de 40 años es del 87% o
mas, pero a los 25 años del 33%
• Obesidad
• Microdeleciones
• Mosaicismo placentario, materno o fetal
• Neoplasias maternas
• Embarazos gemelares – Gemelos con cariotipo discordante
• Feto evanescente
Zhang H, Gao Y, Jiang F, et al. Noninvasive prenatal testing for trisomy 21, 18 and 13 –
clinical experience from 146,958 pregnancies. Ultrasound Obstet Gynecol 2015;45:512-3

58. Para quien no es o que no determina?
• No es un test diagnóstico, es de tamizaje!
• Baja Fracción fetal en pacientes obesas o en edades
gestacionales muy tempranas
• No detecta duplicaciones
• No determina formas especificas de aneuploidias
(por ej. T21 de causa cromosoma extra vs
Translocación Robertsoniana)
• No es un buen examen en casos de Mosaicismo o
mutaciones genéticas simples
• No le va bien con población de bajo riesgo de
aneuploidías ni con aneuploidías de los crom. Sex.
National Society of Genetic Counselors (NSGC) Prenatal Special Interest Group, June 2015.
American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG), June 10, 2015

59. LIMITACIONES de los NIPT
• El tiempo de respuesta del examen dependiendo
de el país donde se haga es variable
• No tamiza para defectos del tubo neural (AFP
debe ser ofrecida)
• El test no reemplaza ni obvia la evaluación por
Eco transvaginal de NT
• Su utilidad en gemelares no esta demostrada
• No predice complicaciones tardías del embarazo
• Costo efectividad para uso masivo
National Society of Genetic Counselors (NSGC) Prenatal Special Interest Group, June 2015.
American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG), June 10, 2015

60. Expresion de los resultados de NIPT
• Detectado – Sospechoso – No detectado
• Positivo – Negativo

61. Novedad !!!

62. Resultados relevantes

63. Pasos a seguir:
• Paciente con Test positivo se va para BVC o
Amniocentesis dx
• Se le debe advertir que condiciones como el
Mosaicismo pueden alterar los resultados de la
BVC
• Si la paciente declina realizarse un test dx se le
realiza seguimiento ecográfico y según condición
médica
• Se deberá en este caso hacer consejería y
evaluación genética post natal
National Society of Genetic Counselors (NSGC) Prenatal Special Interest Group, June 2015.
American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG), June 10, 2015

64. Pasos a seguir:
• Decisiones como una IVE no debe basarse en
los resultados de una prueba de cffDNA
• Reportes indeterminados o ininterpretables
deberán acompañarse de consejería genética
y seguimiento ecográfico mas exámenes
diagnósticos correspondiente
• Un resultado negativo no excluye o asegura
que un feto no este afectado

66. COSTOS
Moneda Local Pesos Colombianos $
(COP)
Estados Unidos US 795-3000* 2.331.000 - 8.796.000
Europa € 631-858 2.190.000 – 2.976.000
Reino Unido £ 400-900 1.560.000 – 3.510.000
Hong Kong HK$ 4500 - 8000 1.698.000 – 3.018.000
Brazil R$ 3.500 3.265.000
*Cubrimiento inconsistente de los seguros de salud
International Journal of Women’s Health 2015:7 113–126

68. Que esta sucediendo con los médicos
(especialistas)a pesar de los datos clínicos?
Datos 2015 de SMMF
5%
52%
13%
30%
A todas
Por solicitud
Como Test dx
Dudas
91% SABIAN BIEN DE QUE LES ESTABAN HABLANDO !!

69. Efecto de NIPT edn procedimientos
invasivos