Las enzimas proteolíticas catalizan la hidrolisis de los enlaces peptídicos de proteínas y participan en variados procesos de vida de las proteínas desde su biosíntesis, control de destino y activación, hasta su degradación. Su síntesis se realiza en forma de zimógeno, de mayor peso molecular que posteriormente es activado por proteólisis. Se pueden clasificar en 2 grandes grupos

1. UNIVERSIDAD POLITECNICA DE SINALOA
Determinación de actividad
proteolítica total
Enzimología
Integrantes:
Bancalari Osuna María Fernanda
González Alba Miguel Ángel
Quevedo Meras Dulce Fernanda
Rodríguez Peinado Areli Gpe.
Tachiquin Carreón Roberto
Trujillo Luna Diana Nereyda
Zambrano Ibarra Monserrat
M.C Rosa Stephanie Navarro
Mazatlán, Sinaloa 18 de Abril del 2016

2. Introducción
Las enzimas proteolíticas (también conocidas como peptidasas) continúan
recibiendo gran atención por el sector industrial, debido al gran rango de
aplicación que poseen en áreas tan diversas como la alimenticia, textil, medica, de
detergentes, entre otras(Salazar et al.,2014).
Las enzimas proteolíticas catalizan la hidrolisis de los enlaces peptídicos de
proteínas y participan en variados procesos de vida de las proteínas desde su
biosíntesis, control de destino y activación, hasta su degradación. Su síntesis se
realiza en forma de zimógeno, de mayor peso molecular que posteriormente es
activado por proteólisis. Se pueden clasificar en 2 grandes grupos: péptidas
(exopeptidasas) y proteinasas (endopeptidasas). (Avilés et al, 1994).
Debido a lo anterior, en los últimos años han surgido nuevos protocolos para
detectar la actividad proteolítica en el laboratorio. Un aspecto clave que influye en
la determinación adecuada de la actividad enzimática en el laboratorio, es la
adecuada elección del sustrato. En este respecto, existen ensayos que pueden ser
utilizador para detectar la actividad de una enzima en específico o inclusive otros
ensayos pueden aportar información relacionada con la actividad de varias
enzimas presentes en un extracto crudo (Sarath et al.,2003).
Los sustratos más comúnmente utilizados para evaluar la actividad proteolítica
son los sustratos “naturales” tales como la gelatina, caseína y hemoglobina. Otras
alternativas a este tipo de sustrato son los derivados cromogénicos de las
proteínas antes mencionadas, tales como la azogelatina y la azocaseina. La
utilización de sustratos cromogénicos para medir la actividad proteolítica es muy
conveniente, ya que se basan en la liberación de péptidos “coloridos” de bajo peso
molecular a partir del sustrato cromogénico. Estos péptidos son solubles y
presentan un máximo de absorbancia en la región del visible, por lo que la

3. actividad enzimática se puede medir utilizando un espectrofotómetro (Sarath et al.,
2003).
Objetivos:
Objetivo general.
 Determinar la actividad proteolítica de la enzima proteasa comercial de
Bacillusspp.
Objetivos específicos.
 Comparar la actividad enzimática de la enzima proteasa a diferentes
concentraciones.
 Interpretar los resultados obtenidos de las concentraciones.
Materiales y equipos
 Espectrofotómetro
 Potenciómetro con
soluciones de calibración
de ph
 Celdas para leer en rango
del visible
 Microtubos de 2 Ml
 Gradillas para microtubos
 Micropipetas y puntas
 Tubos de ensaye de vidrio
 Gradilla para tubos de
vidrio
 Cristalería para
preparación de buffers y
sustrato.

4. Reactivos
 Azocaseina 2% p/v
 Proteasa comercial de
Bacillusspp
 Tris base
 HCL 1M
 NaOH 1M
 Ácido tricloroacético 20%
p/v
Determinación de actividad proteolítica total
Preparación del extracto enzimático
Se pesarán 0.0130 g de proteasa comercial proveniente de
Bacillusssp. Y se disolverá por completo en un microtubo que
contenga 2 mL de buffer Tris-HCl 0.1 M, pH 8. Posteriormente, se
realizara diluciones.
Las disoluciones obtenidas se utilizarán para determinar la actividad
proteolítica total.
Protocoló para la determinación de actividad proteolítica total (APT)
solución tubos actividad tubos control
extracto
enzimatico
100 µl 100 µl
buffer 50 µl 500 µl
TCA 20% p/v 500 µl
azocaseína 2%
p/v
500 µl 500 µl
correr reacción 30 minutos, temperatura ambiente
TCA 20% p/v 500 µl
Incubar en refrigeración 20 minutos para asegurar
precipitación de proteínas.
Centrifugar 15000 rpm/20 minutos
Transferir 1 mL de sobrenadante a tubos de ensaye que
contengan 1 ml de NaOH 1 M
Determinar la absorbancia de esta solución a 440 nm.

5. Resultados y discusiones
Los datos de absorbancia obtenidos se expresan como el ΔAbs 440 nm utilizando la
siguiente relación:
Δ Abs 440 nm = Abs 440 nm actividad – Abs 440 nm control
El valor obtenido de ΔAbs 440 nm será dividido entre el tiempo de reacción (en
minutos).
Azocaseína
%(p/v)
ΔABS
440 NM
Promedio Control Promedio
Abs.
Actividad/Tiempo
Abs.
Control/
Tiempo
Concentración
0,0250
0,018
0,017
0,009
0,017 0,001 0,001 0,0000,029 0,019
0,004 0,023
0,0500
0,02
0,039
0,059
0,063 0,001 0,002 -0,0010,059 0,078
0,039 0,053
0,1000
0,25
0,256
0,018
0,020 0,009 0,001 0,0080,271 0,020
0,247 0,023
0,5000
0,968
0,911
0,049
0,044 0,030 0,001 0,0290,901 0,030
0,865 0,054
1,0000
1,355
1,341
0,171
0,186 0,045 0,006 0,0391,322 0,253
1,346 0,133
2,0000
1,902
1,910
0,323
0,406 0,064 0,014 0,0501,963 0,456
1,866 0,439
3,0000
1,55
1,559
0,072
0,278 0,052 0,009 0,0431,59 0,7
1,536 0,062
4,0000
1,042
1,070
0,142
0,197 0,036 0,007 0,0291,078 0,25
1,09 0,2

6. -0.010
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
0.060
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Absorbancia440nm/30minutos
Azocaseína % (p/v)
Relación de la concentración de sustrato sobre
la velocidad de la reacción enzimáica
Km
Vmax
Azocaseína
%(p/v)
ΔABS 440 NM 1/[S] 1/v0
0,025 0,000 40,000 40,000
0,05 -0,001 20,000 30,000
0,1 0,008 10,000 25,000
0,5 0,029 2,000 21,000
1 0,039 1,000 20,500
2 0,050 0,500 20,250
3 0,043 0,333 20,167
4 0,029 0,250 20,125
Gráfica 1. Relación de la concentración de sustrato sobre la velocidad dela reacción enzimática

7. En la gráfica1, muestra la velocidad de la reacción a una determinada
concentración de sustrato, en la cual se puede observar que la velocidad va
aumentando con forme aumenta la concentración de sustrato llegando a obtener
la velocidad máxima de la reacción (vmaax) cuando la concentración de
azocaceina es de 2% (p/v) con una absorbancia de 0.0050 medida a 400 nm.
La imagen 1 muestra resultados obtenidos por Cruz 2011, en el cual reporta
actividades proteolíticas de bacterias en función a su crecimiento microbiano, en el
cual la actividad oscila entre 0.007 y 0.0043, la cual comparandola con la
obtenida durante este trabajo es similar ya que se encuentra dentro de los
rangos.
Sin embargo se puede observar en la tabla 2 que los valores de absorbancia
dentro de la concentraciones 1 y 2 fueron mayores que las concentraciones 3 y 4,
siendo que cuando se tienen mayores concentraciones de sustrato la absorbancia
tiene que ser proporcional a la concentración, pero con la grafica 2 se puede
corroborar que las absorbancias correspondienes a las concentraciones de
sustrato son adecuadas.
y = 0.5x + 20
0.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000
1/V0
1/ ]S]
Relación de la concentración de sustrato
sobre la velocidad de la reacción enzimática
Gráfica 2. Relación de la concentración de sustrato sobre la velocidad dela reacción enzimática.

8. En la gráfica1 se puede ver que entre menor era la concentración de azocaseína,
que es el sustrato, la enzima alcanzaba su máxima velocidad al contrario cuando
la concentracion de azocaseina era mayor, la velocidad a la que consumia el
sustrato fue disminuyendo pues la enzima ya se encontraba saturada.
Tanto la gráfica1 como la gráfica 2 representan los resultados obtenidos en cuanto
a la relacion con la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción
enzimática, ya que es notable que al umento de la concentración de sustrato la
velocidad a su vez aumente, pero se observa que apartir de la concentracion 3
hay un declive, es decir que la velocidad de la reacción empieza a disminuir; esto
se puede ver afectado por vario factores, principal mente el tiempo, ya que esta
practica requería de la presición de los tiempo y al agregar las sustancias y/o
reactivos, puesto que el agregar un reactivo antes del tiempo establecido swe
pudo ver afectado en gran manera los resultado, entre otros factores como la
persona que operó cada actividad.
Imagen 1.Actividad proteolítica de Penicillium Spp. (Cruz C. 2011).
Conclusiones.
Se determinó la actividad proteolítica utilizando azocaseína como sustrato, en el
cual se obtuvo la relación entre la concentración del sustrato y la velocidad de la
reacción enzimática. La actividad máxima mostrada prácticamente fue a una
concentración de 2% (p/v) de azocaseína.

9. Las proteasas catalizan la hidrolisis de los enlaces peptídicos de proteínas y
participan en diversos procesos de vida de las proteínas, ya sea desde su síntesis
hasta su degradación. Un factor importante que influye en estas, es la temperatura
ya que se sabe que el incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta
ciertos límites por lo contrario el calor afecta ya que es un factor que desnaturaliza
las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde
su actividad debido a que se desnaturaliza, por este motivo fueron incubadas a
distinta temperatura.
La actividad proteolítica se ve vio afectada por el pH inicial ya que esta actúa
sobre las proteínas hidrolizando enlaces peptídicos a PH óptimo de 7, sin
embargo ejercen un efecto importante sobre la actividad enzimática y producción
de proteína total, presentando resultados a pH 8; debido a que las enzimas
normalmente tienen un pH neutro para poder tener una buena actividad
enzimática, excepto claramente las enzimas encontradas en el estomago las
cuales su pH optimo es acido
Se comparó la actividad enzimática de la enzima proteasa a diferentes
concentraciones, teniendo como resultados la velocidad de consumo en la cual la
enzima actúa ante diferentes concentraciones de sustrato, obteniendo resultados
coherentes y que correspondían con la actividad de la enzima.
Referencias Bibliográficas.
 Aviles, X.; Guasch, A y Vendrell, J.Activación de precursores de
proteínas.ResearchBulletin, 1994, vol. 100, No. 210, p. 74-81
 Cruz C. (2011). Caracterización parcial de una proteasa alcalina a partir de
hongos filamentosos implicados en el deterioro de documentos históricos.
Colombia: Universidad Nacional de Colombia.
 Sarah,G, de la Motte, IR, & Wagner, F (2003). Protease assay. Proteolytic
enzymes: a practical approaclh, 3,25-55