Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores para reacciones bioquímicas. Se caracterizan por acelerar las tasas de reacción de manera específica, regular reacciones y vías metabólicas, y requerir cofactores en algunos casos. Las enzimas incrementan enormemente las tasas de reacción a través de la formación de un complejo enzima-sustrato que conduce a la liberación de productos. Diferentes clases de enzimas utilizan estrategias como la catálisis covalente, ácido

1. Enzimas y catálisis

2. Enzimas Son típicamenteproteínasquesirvencomocatalizadoresparalasreaccionesbioquímicas. Algunos ARNs (ribozimas) y anticuerpos (abzimas)handemostradocapacidadcomocatalizadores. Se caracterizanpor: 1. Catálisissobre la tasa de lasreacciones 2. Especificidadporsubstrato la cualvaría con la enzima 3.Regulaciónde reacciones o vias 4. Cofactores Algunasusancofactores y otras no.

3. Clasificación de enzimas Sistemaoficial: Lactatodehidrogenasa= EC 1.1.1.27

4. Incremento de la tasa de lasreacciones Formación del ácidocarbónico a partir de CO2 y H2O. Tasa no catalizada = 1.3 x 10-1moléculas/seg Tasacatalizada = 1.0 x 106 moléculas/seg Incremento = 7.7 x 106 veces Anhidrasacarbónica

5. Incrementos en la tasa de reacciónporalgunasenzimas

6. Ejemplos de ActividadEnzimática Catálisis del rompimiento de un enlace peptídico proteasa

7. Actividadesterasa Muchasproteasamanifiestanactividadesterasa (capacidad romper enlaces ester).

8. Rompimiento de un enlace peptídico El “clivaje” ocurre en el ladocarboxilo de unacadena lateral. Trypsin

9. Cofactors Algunasenzimasrequierencofactoresparasuactividad (Apoenzima + Cofactor = Holoenzima)

10. Go'y Keq' Keq' = 0.0475 Triosafosfato Isomerasa DGo' = - RT lnKeq' = - 8.314(298) ln0.0475 DGo' = - 2478 (-3.05) = 7550 J/mol = 7.55 kJ/mol

11. ‘

12. TasaCatalizadavsNo catalizada Medición de la formación de producto (o la pérdida de sustrato) con el tiempo

13. Modelos de formación del Complejo ES

14. k1 k2 E + S ES E + P k-1 Tasa de Reacciónvs[S] ES e un complejo no covalente

15. ComplejoEnzimaSubstrato, ES (no covalente)

16. Residuos del sitioactivo No tienenqueestaradyacentes en la secuencia. La estructura 3o los posiciona en el sitioactivo.

17. Llave& Cerradura– Fischer (1894)

18. AjusteInducido– Koshland (1963)

19. Estrategias de catálisis Catálisis Covalente: El sitio activo contiene un grupo reactivo, usualmente un nucleófilo fuerte que temporalmente es modificado covalentemente durante la catálisis. (Ej: El aa Ser en la Quimitripsina) Catálisis Acido-Base: Una molécula diferente del agua juega el papel de donante o aceptor de un protón. (Ej: La función del aaHis de la Quimotripsina) Catálisis con ion metálico: Ocurre de varias maneras. El ion metálico como catalizador electrofílico para estabilizar la carga negativa en un intermediario de la reacción. El ion puede generar un nucleófilo por el incremento de la acidez de en una molécula cercana. El ion puede unirse al sustrato contribuyendo a la fuerza de interacción E-S. Catálisis por Aproximación: En reaccione que implican dos sustratos, la tasa se incrementa cuando la enzima provee una superficie que permite la orientación correcta de los mismos . (El: La s NMP quinasas.

20. Clases de Proteasas Proteasas Serina

21. Clases de Proteasas

22. Clases de Proteasas Proteasas Serina

23. Clases de Proteasas Proteasas Serina

24. Clases de Proteasas Proteasas Cisteína

25. Clases de Proteasas Aspartil Proteasas

26. Clases de Proteasas Metaloproteasas

27. k1 k2 E + S ES E + P k-1 Cinética [E] = Enzyme concentration [S] = Concentración de sustrato [ES] = Concentración del complejo Enzima-Sustrato [P] = Concentración de producto k1 = Constante de formation de ES k-1 = Constante de descomposición de ES k2 = Constante de descomposición de ES

28. k1 k2 E + S ES E + P k-1 Gráfica de Michaelis-Menten Relacióngráfica entre la velocidad de reacción y concentración de substrato Order Cero (Alta [S]) Primer Orden (Baja [S])

29. Velocidadinicial, Vo Tasa al comienzo de unareaccióncatalizadaporunaenzima

31. k1 k2 E + S ES E + P k-1 The Michaelis-MentenEquation Asumiendocondiciones de estadoestacionario: Formation ES = Descomposición de ES Definimos la “Constante de Michaelis” como: KM = (k-1 + k2) / k1 La velocidad general de reacciónes dada por la tasa de conversion de ES en E + P. v = k2[ES] = kcat[ES]

32. Reaction Constituents

33. k1 k2 E + S ES E + P k-1 Derivación de la ecuación de Michaelis-Menten 1. Tasa general de formación de producto: v = k2 [ES] 2. Tasa de formación de [ES]: vf= k1[E][S] 3. Rate of decomposition of [ES]: vd= k-1[ES] + k2 [ES] ES formation = Descomposition de ES (Estado estacionario) 4. Portanto: k1[E][S] = k-1[ES] + k2 [ES]

34. Derivación de la ecuación de Michaelis-Menten 5. Resolviendopara [ES], usamos el balance de enzimaparaeliminar [E]. ET = [E] + [ES] k1 (ET - [ES])[S] = k-1[ES] + k2 [ES] k1 ET[S] - k1[ES][S] = k-1[ES] + k2 [ES] 6. Factorizando: K1(ET[S] - [ES][S]) = (k-1 + k2) [ES] ET[S] = KM [ES] + [ES][S] ET[S] = (KM + [S]) [ES]

35. Derivación de la ecuación de Michaelis-Menten ET[S] 10. Continuando: [ES] = ----------------------- KM + [S] 11. Multiplicandopork2: k2ET [S] k2 [ES] = ----------------------- KM + [S] 12. Dado que: “Vo = k2 [ES]” “Vmax = k2 [ET]” Vmax[S] vo = ----------- KM + [S]

36. GráficoMichaelis-Menten Relates reaction velocity and substrate concentration Vmax[S] vo = ----------- KM + [S]

37. GráficoLineweaver-Burke Gráfica del doblerecíproco 1 KM+ [S] ---- = ---------------- voVmax[S] 1 KM1 1 ---- = ------ • ---- + ----- voVmax[S] Vmax f(x) = mx + b

38. k1 k2 E + S ES E + P k-1 Constantecatalíticakcat En unareaccióncatalizadaporenzima, la tasa general de formación de productoes: v = k2 [ES]. Si todaslasmoléculas de enzimaestán en complejocomosustrato(exceso de S), se da la máximavelocidad de reacción: Vmax= kcatET aquí, kcates la constante general de reacción. kcat= Vmax/ET kcat = Número de recambio

40. Generalmente, a menor valor numérico de KM, la unión ES es más fuerte.

42. = kcat (s-1)

43. EficienciaCatalítica (kcat/KM) kcat/KM= Eficiencia Al reescribirkcat/KM en términos de lasconstantescinéticas se obtiene: kcatk1k2 ------- = ----------- KM k-1 + k2 Portanto, cuandok2espequeña, el denominador se convierte en “k-1” y kcat/KMespequeña

44. EficienciaCatalítica (kcat/KM) kcat k1k2 ------- = ----------- KM k-1 + k2 Y cuando k2 es grande, el denominador se convierte en k2 y kcat/KM estará limitada por el valor de k1, es decir, la formación del complejo ES. Su formación es a su vez limitada por la tasa de difusión de S al sitio activo of E. Este valo máximo teórico en solución acuosa es: ~109 sec-1 M-1

45. EficienciaCatalítica (kcat/KM)

47. Reacciones Multi-substrato SecuencialOrdenado Ordenado= todos los reactivosunidos antes de que la reacciónocurra LDH LDH: Lactato deshidrogenasa

48. Notación de Cleland Ordenadosecuencial

49. Reacciones Multi-substrato Ordenado al azar Creatina Quinasa

50. Notación de Cleland Ordenado al azar

51. Reacciones Multi-substrato Ping Pong Substrate and product alternate in and out

52. Notación de Cleland Ping Pong

53. InteracciónAlostérica Modelos a) En el modelo concertado, la enzima existe sólo en dos conformaciones. Los sustratos y los activadores poseen una mayor afinidad por el estado R. Los inhibidores favorecen el estado T. (b) En el modelo secuencial, una subunidad asume una conformación R al unirse al sustrato. Conforme la primera subunidad cambia su conformación, se afecta la afinidad de las subunidades cercanas por los ligandos. R T

54. InteracciónAlostérica

55. Inhibición de la Actividad Unión no covalente del inhibidor: Competitiva (I se une solo a E) Incompetitiva (I se une solo a ES) No competitive (Ise une a E o a ES) Unión covalente del inhibidor– irreversible Grupoespecífica Análogos del estado de transición Suicidas

56. Inhibition competitiva

57. InhibiciónCompetitiva (I se une solo a E)

58. Inhibición Competitiva KMi = KM· α [I] Ki KMi = KM(1+ ------) KMaumenta; VMigual

59. Inhibición Competitiva Dihidrofolato reductasa Methotrexate Aminopterina Trimethoprim

60. Inhibición Competitiva Dihidrofolato reductasa

61. InhibiciónIncompetitiva

62. InhibiciónIncompetitiva (I se une solo a ES)

63. Inhibición Incompetitiva α = (1 + [I]/Ki) KM KMi = α VMAX KM & VMdisminuyen VMAXi = α

64. Inhibición no Competitiva

65. Inhibition no Competitiva (I se unetanto a E como a ES)

66. Inhibition no Competitiva VMAX KMigual; VMAXdisminuye VMAXi = α

67. Inhibición Irreversible - Grupo Específica DIPF: Diisopropilfosfofluoridato

68. Inhibición Irreversible - GrupoEspecífica

69. Inhibición Irreversible porAnálogos del Sustrato

70. Inhibición Irreversible porAnálogos del Sustrato Bromoacetol Fosfato: Análogo de la Dihidroxiacetona fosfato

71. Inhibición Irreversible –Basada en el Mecanismo de Reacción El inhibidor es modificado por la enzima antes de unirse covalentemente a ella. Suicidio

72. Análogos del Estado de Transición Inhibidor ProlinaRacemasa

73. Abzimas Anticuerpos con actividad enzimática La inserción de un ion metálico en una porfirina (enzima ferroquelatasa) procede a través de un estado de transición en que su estructura es doblada. La N-Metilmesoporfirina es análogo de dicho estado que puede usarse para generar Abs capaces de catalizar la inserción de un ion metálico a la porfirina. Porfirina N-Metilmesoporfirina