¿Conoces cómo se estudian los Biofilms bucales? Conoce las técnicas y métodos llevados a cabo desde DENTAID Research Center.

1. ESTUDIO DE
BIOFILMS
BUCALES
DEPARTAMENTO MÉDICO DENTAID

2. Las bacterias de la cavidad oral pueden estar en la saliva o adheridas
a las superficies bucales (mucosas, lengua, dientes)
Biofilms bucales: agrupaciones bacterianas embebidas en matrices
que se adhieren a superficie.
Composición: 15-20% población microbiana
80-85% matriz de polisacáridos extracelulares,
proteínas, sales minerales y material celular
Localización en diente: supragingival
subgingival
interproximal
DEFINICIÓN

3. PATOGENICIDAD
BIOFILMS
Supragingival e
Inteproximal
Bacterias cariogénicas
Destrucción del
esmalte dental
Subgingival
Inflamación y
destrucción del
periodonto
Bacterias
periodontopatógenas
CARIES GINGIVITIS PERIODONTITIS

4. Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Fusobacterium nucleatum
Tannerella forsythia
Campylobacter rectus
Eikenella corrodens
Parvimonas micra
Selenomonas spp
Eubacterium spp
Treponema spp
700 especies bacterianas están presentes
en el biofilm bucal
DIVERSIDAD BACTERIANA
DE LA CAVIDAD BUCAL

5. FORMACIÓN DE BIOFILMS
Formación de película
adquirida con proteínas
salivares sobre el esmalte
1
Adhesión de colonizadores
primarios: bacilos y cocos gram
positivos (S. sanguis, S.
oralis,…) y crecimiento
2
Unión de Fusobacterium
nucleatum: facilita la adhesión
de otras bacterias (gram
negativas, anaerobios…)
3
4 Colonizadores terciarios.
Incremento de la complejidad:
gram negativos, anaerobios
estrictos
4 μm4 μm

6. Las bacterias, al crecer en forma de biofilms, actúan como una
comunidad bacteriana, lo que les otorga las siguientes propiedades:
 Heterogeneidad fisiológica
 Mayor resistencia fenotípica
 Quorum sensing (comunicación interbacteriana)
 Capacidad adaptativa
 Resistencia a los agentes antimicrobianos
PROPIEDADES DE LOS BIOFILMS

7. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE BIOFILMS
Las bacterias aisladas (planctónicas) tienen diferente
comportamiento y propiedades que cuando están
organizadas en biofilms.
Estas propiedades diferentes les confieren un incremento en
la resistencia frente a antisépticos y un aumento en su
patogenicidad.
Por tanto, es necesario estudiar el comportamiento de las
bacterias en biofilms y poder prevenir así las patologías
bucales que puedan causar.

8. Desarrollo Biofilm in vitro
Crecimiento estático Crecimiento en flujo
Biofilm maduro
Cultivo en placa Técnicas moleculares Técnicas microscópicas
 PCR
 PCR-RT
 PCR-RT-PMA
 Microscopía electrónica de
barrido (SEM)
 Microscopía de láser confocal
(CLSM)
Ensayos

9. DESARROLLO BIOFILM IN VITRO
 Crecimiento estático
Se realiza en placas microtiter. Se usan inóculos orales (de
saliva o placa subingival) o una selección de bacterias supra y/o
subgingivales.
Se intentan reflejar condiciones fisiológicas de la boca (pH, Tª,
anaerobiosis).
No se puede recrear el dinamismo característico de la boca:
flujo salival y flujo crevicular al que están sometidas las
bacterias.
Este dinamismo condiciona las propiedades estructurales
del biofilm.
Estudios demuestran que la estructura y propiedades del biofilm
varían dependiendo de si el crecimiento es estático o en flujo
Placa microtiter

10. DESARROLLO BIOFILM IN VITRO
 Crecimiento en flujo
- Modelo de estudio que permite la formación de biofilm oral multiespecie in vitro en
condiciones similares a la realidad, gracias al sistema en flujo
- Crecimiento similar al que obtendríamos en la cavidad bucal

11. ENSAYOS
 Sobre los discos de hidroxiapatita donde está el biofilm
maduro, se realizan distintos ensayos, con el fin de
evaluar su comportamiento.
 Estos ensayos fundamentalmente incluyen el uso de
antisépticos, y están orientados a evaluar su eficacia
y/o la resistencia del biofilm
 También se realizan ensayos sobre la matriz
extracelular (80% del biofilm), que tiene gran influencia
en propiedades del biofilm como la resistencia a los
antisépticos.

12. CULTIVOS
 Cultivo en placa
- El biofilm maduro y tratado se siembra en medios de cultivo apropiados para su
crecimiento.
- En función de las características metabólicas de las especies, se utilizan diferentes medios
de cultivo.
- Posteriormente, se evalúa la población microbiana que ha crecido (de forma cualitativa y
cuantitativa).
Cámara de anaerobiosis

13.  PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
Son técnicas de extracción de DNA. Con estas técnicas, es
posible amplificar el DNA bacteriano de una muestra:
- PCR: Cualitativa. Detecta DNA mediante señal en gel de
electroforesis
- PCR-RT (PCR en tiempo real): permite cuantificar el
producto de esta amplificación a medida que se va
sintetizando mediante fluorocromos
- PCR-RT-PMA (PCR-RT con propidio de monoazida).
Gracias a la adición del PMA, es posible diferenciar
entre DNA de bacterias vivas y muertas, valorándose así
la eficacia de antisépticos
TÉCNICAS MOLECULARES

14.  Microscopio óptico de láser confocal (CLSM)
• Aumento de la resolución
• Capacidad de penetración en el biofilm
• Obtención de imágenes de secciones ópticas extremadamente finas.
• Se consigue enfoque sobre un único plano.
• Nos permite identificar y cuantificar la población bacteriana viva y muerta:
VALORACIÓN DE EFICACIA DE ANTISÉPTICOS
TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA

15. Imágenes en un microscopio Óptico de Láser Confocal de un biofilm oral desarrollado in Vitro. En verde se observan los
microorganismos marcados con Syto9 (vivos) y en rojo se observan los microorganismos marcados con Ioduro de Propidio
(muertos).
La imagen de la izquierda corresponde a un control negativo y la de la derecha es la misma población bacteriana tras el
tratamiento con Clorhexidina 0,12% + CPC 0,05% (Perio·Aid Tratamiento)
Imágenes de microscopía de láser confocal
CHX 0,12% + CPC 0,05%
PERIO·AIDControl negativo

16.  Microscopio electrónico de barrido (SEM)
EVALUACIÓN DE RESULTADOS –
TÉCNICAS MICROSCOPÍA
• Aumento de la resolución hasta más de 100.000 veces.
• Haz de electrones (en lugar de haz de luz) que “barre la muestra”, punto por punto de la
muestra.
• Imágenes tridimensionales realistas sobre la superficie de un objeto
• Gran profundidad de campo
• Obtención de imágenes de la estructura del biofilm (morfología bacteriana,
interconexiones, matriz, etc.)

17. Imágenes de microscopía electrónica de barrido
Diferentes micrografias tomadas con SEM pertenecientes a biofilms orales mono y multiespecie
desarrollados en el laboratorio de microbiologia de Dentaid Research Center.

18. @Dentaid