Este documento proporciona una introducción a la microscopía electrónica. Explica que la microscopía electrónica permite ver estructuras más pequeñas que la microscopía óptica debido a la longitud de onda más corta de los electrones. Describe los componentes básicos de un microscopio electrónico de transmisión como el cañón de electrones, las lentes magnéticas y el sistema de vacío. También resume los diferentes tipos de microscopía electrónica como la de transmisión y la de barrido.

1. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Vicente Medina Reus 2012

2. La observación directa es el primer paso en la investigación pero… ¿se ve lo que se mira?

3. “ El ciego se entera mejor de las cosas del mundo, los ojos son una ilusión embustera” José Mª del Valle Inclán 10 -3 m 10 3 m MICROSCOPIO TELESCOPIO Concepto Microscopía óptica y electrónica Construcción (partes) de un ME Microscopía y resolución Tipos de ME: TEM y SEM Interacción de los e- con la materia Aplicaciones Preparación de muestras al TEM Contraste. Sombreado Fijación, Deshidratación, Iinfiltración Ultramicrotomía Imágenes TEM Preparación de muestras al SEM Vaporización Imágenes SEM Microanálisis Rayos-X Combinación TEM y SEM Otras microscopías

4. electrones en lugar de fotones o luz visible MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, basándose en los estudios de Louis-Victor de Broglie sobre las propiedades ondulatorias de los electrones MET de la UdL

5. SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS ENTRE M. ÓPTICA Y M. ELECTRÓNICA observación lentes formación Imagen objetivos condensador Fuente de “iluminación” espécimen (muestra) Los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible por lo que permiten mostrar estructuras mucho más pequeñas MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

6. Las partes principales de un microscopio electrónico de transmisión TEM son: CAÑÓN DE ELECTRONES , que emite los electrones que chocan o atraviesan el espécimen (dependiendo que tipo de microscopio electrónico es), creando una imagen aumentada. LENTES MAGNÉTICAS para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. SISTEMA DE VACÍO es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. PLACA FOTOGRÁFICA o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. SISTEMA DE REGISTRO que muestra la imagen que Producen los electrones, que suele ser un ordenador

7. CONSTRUCCIÓN DEL TEM Los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como emisión termoiónica o bien mediante emisión de campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de un potencial eléctrico (medido en V, o voltios) y se focalizan mediante lentes electrostáticas o electromagnéticas.

9. RESOLUCIÓN MINIMA DISTANCIA ENTRE DOS PUNTOS DE UNA MUESTRA PARA QUE PUEDAN SER DISTINGUIDOS COMO TALES Poder de resolución (R) R = 0.61  / n sen    = longitud de onda de iluminación n = índice de refracción  = semiángulo de apertura del haz incidente   = h / mV h = constante de Planck m = masa de e - V = velocidad de e - Ej.: para V = 60.000 V;  = 0.05 nm, la R es de 0.2 nm

10. TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS Transmission electron microscope (TEM) Scanning electron microscope (SEM) TRANSMISIÓN BARRIDO O RASTREO e - e - e - e -

11. Interacción de los e - con la materia

12. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO Aceria ficus en el envés de una hoja de higuera Microanálisis de un mineral

13. PRESTACIONES O POSIBILIDADES

14. Preparación y observación de muestras para TEM

15. IMAGEN DE TEM de alta resolución de un límite de grano de inclinación en aluminio

16. Rejillas de cobre, oro, platino Soporte muestras Portaobjetos

17. CONTRASTE (TINCIÓN) DE SOLUCIONES O PURIFICADOS TINCIÓN SENCILLA : acetato de uranilo, ácido fosfotúngstico, heptamolibdato amónico, citrato de plomo Tobamovirus Geminivirus Potyvirus Contraste positivo Contraste negativo Contraste negativo + positivo

18. Fotografía electrónica (TEM, tinción negativa con acetato de uranilo) del viroide del tubérculo fusiforme de la patata (flechas) comparada con el DNA de doble cadena de un virus bacteriófago (bacteriófago T7) (T. Koller y M. Sogo)

19. Microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa SOMBREADO DE SOLUCIONES O PURIFICADOS Microscopía electrónica de transmisión con sombreado Vaporización de un metal pesado sobre en ángulo) la muestra El material evaporado sigue una línea recta en alto vacío Muestra Vapor de metal Superficie del espécimen cubierta por el metal Sombra Sombra 1 Sombra 2 Ángulo 1 Ángulo 2 Bomba vacío Superficie del virión Cubierta con metal Sombra ángulo 1 Sombra ángulo 2

21. FIJACIÓN ¿Objetivo? Preservar la estructura de la materia viva sin alterarla ¿Cómo? Mediante entrecruzamientos/ligamientos transversales de lípidos y proteínas principalmente FACTORES pH osmolaridad constitución iónica temperatura tiempo de fijación tamaño de la muestra Medio FIJADORES TAMPONES Tetróxido de osmio Tetróxido de rutenio Aldehídos: formaldehído glutaraldehido Acroleína Permanganato potásico Permanganato sódico Fosfato Cacodilato Veronal acetato Colidina

23. ULTRAMICROTOMO Cuchillas de vidrio p diamante Rejillas de cobre (estándar), o de oro/platino para inmunomarcaje

24. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ANALÍTICA DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

25. IMÁGENES COLOREADAS AL TEM (falso color) Salmonella typhimurium Virus de la gripe aviar A H5N1 Célula de mamífero

26. Lettuce infectious yellows virus (LIYV) Tian, T, Rubio, L, Yeh, HH, Crawford, B, Falk, BW. 1999. Lettuce infectious yellows virus: in vitro acquisition analysis using partially purified virions and the whitefly Bemisia tabaci. J Gen Virol 1999 80: 1111-1117 Agranovsky, A.A., Lesemann, D.E., Maiss, E., Hull, R., Atabekov, J.G. 1995"Rattlesnake" structure of a filamentous plant RNA virus built of two capsid proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. March 28; 92(7): 2470–2473. CP CP CPm CPm Beet yellows virus (BYV)

27. INMUNOMARCAJE COMBINACIÓN DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICAS BASADAS EN LA REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO INMUNOMARCAJE CON ORO COLOIDAL Marcaje de la proteína LAMP-1 en la membrana de un cuerpo multivesicular de una célula HepG2 Marcaje de residuos de manosa 6-fosfato en el interior d lisosomas de los linfoblastos

28. Preparación y observación de muestras para SEM Granos de polen

29. “ Sputtering”

30. Ojo de Drosophila melanogaster

31. CRIO-SCANNING Haz vascular de hoja de maíz

32. Bemisia tabaci ( GENNADIUS)

33. Cicadulina mbila NAUDE Brocosomas: gránulos de naturaleza proteica secretados por los tubos de Malpigio de los cicadélidos

34. A. Célula. B. TEM-criofractura de la mezcla BHPB/C6H12 (2 %). Barra = 100 nm CRIOFRACTURA Congelar en propano Cuchilla de acero Línea de fractura Réplica Hielo Hielo Fuente de carbono o platino (ángulo)

35. IMÁGENES SEM COLOREADAS (falso color)

37. BSE Si Fe Ni P Ti Combinación de imágenes: electrones retrodispersados (BSE) y análisis de rayos X en mineralogía

38. SCANNING TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE (STEM) A. Vista general de un STEM . B. Hemoglobina liofilizada de una lombriz de tierra con partículas de TMV . C. Detalle de B. D. Virus bacteriófago. E. IGL de C. A B C D E

39. Micrografías de células de Candidatus M, bavaricum (Mbav). A. Al SEM por detección simultánea electrones secundarios (azul) y retrodispersados (rojo). Las cadenas de magnetita son visibles. B-D. Al TEM de secciones ultrafinas células congeladas mediante alta presión o criosubstituidas (CM: membrana citoplásmatica, OM: membrana exterior, PG: peptidoglicanos, OL1: parte interior de la capa exterior, OL2: parte exterior de la capa exterior; los asteriscos señalan los pliegues o pailas del espacio periplasmático. E. Sección FIB (“focused ion bean”) mostrando la red de extensión de los pliegues. F y G. TEM y SEM de células congeladas por alta presión y criofracturadas. Los círculos señalan los cristales de marnetita (margetosomas) COMBINACIÓN DE TÉCNICAS

41. Hebras de resina epoxi enlazadas a una esfera de poliestireno de 2,5 micrómetros. Nanoestructuras de óxido de zinc sobre una capa de óxido de indio (la técnica es espectacular). Espermatozoides en la superficie de un óvulo Nitruro de wurtzita e indio cristalizado

42. MICROSCOPIO DE BARRIDO DE EFECTO TUNEL (STM) Lámina de oro Nanotubo de carbono

43. MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA (AFM)

44. MICROSCOPIA LÁSER CONFOCAL

45. SABER OBSERVAR Vicente Medina [email_address]