Producción de cefalosporinas C

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MONOGRAFIA CEFALOSPORINAS

PRODUCCION DE CEFALOSPORINAS C
ELENA ALICIA PONCE TORRES
5/18/2011

TITULAR DE LA MATERIA: DR. RUBEN MARQUEZ M.


INDICE
1. INTRODUCCION…………………………………………………………………….. 4

2. CEFALOSPORINAS…………………………………………………………………...5
3. ESTRUCTURA…………………………………………………………………………6

4. CLASIFICACION……………………………………………………………………….8
4.1 GENERACIONES DE CEFALOSPORINAS……………………………………….8

5. MECANISMOS DE ACCION………………………………………………………...10

6. BIOSINTESIS DE CEFALOSPORINAS……………………………………………11

6.1 MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA BIOSÍNTESIS DE CPC………….14

6.1.1 REGULACIÓN POR LA FUENTE DE CARBONO…………………………….14

6.1.2 REGULACIÓN POR LA FUENTE DE NITRÓGENO………………………….15

6.1.3 AMINOÁCIDOS COMO PRECURSORES Y MEDIADORES DE LA
REGULACIÓN……………………………………………………………………………15

6.1.4 REGULACIÓN POR FOSFATO…………………………………………………16

6.1.5 REGULACIÓN POR PH AMBIENTAL………………………………………….16

6.1.6 EFECTO DEL OXÍGENO EN EL SISTEMA RESPIRATORIO Y EN LA
PRODUCCIÓN DE CPC………………………………………………………………..18

7. PRODUCCION DE CEFALOSPORINAS…………………………………………..18

7.1 PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS………………………………………………18

7.2 FERMENTACION……………………………………………………………………24

7.2.1 CULTIVOS EN MEDIO LÍQUIDOS……………………………………………..25
7.2.2 CULTIVOS EN MEDIO SÓLIDOS………………………………………………26

7.3 SINTESIS DE CEFALOSPORINAS………………………………………………27

7.3.1 SECUENCIA GENERAL DE SINTESIS………………………………………..27

7.4 ECONOMIA………………………………………………………………………….28

BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………………..29

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INDICE DE TABLAS

TABLA 1 ESTRUCTURA DE CEFALOSPORINAS Y CEFAMICINAS…………..7

TABLA 2 CLASIFICACION DE CEFALOSPORINAS POR GENERACIONES…9

TABLA 3 RUTA DE BIOSINTESIS DE LA CEFALOSPORINA………………….13

TABLA 4 EFECTOS DE PH EN PRODUCCION……………………………….....17

IMAGEN 6 PREPARACION DE INOCULO………………………………………..19

TABLA 7 PERFIL DE FERMENTACION……………………………………………20

IMAGEN 8 PLANTA TIPICA DE FERMENTACION………………………………..22

IMAGEN 9 VASIJA TIPICA DE FERMENTACION…………………………………23

3


INTRODUCCION
Los antibióticos betalactámicos son los antimicrobianos más prescritos, tanto en
atención primaria como en los hospitales. A pesar de que no se dispone de ningún
betalactámico realmente nuevo desde hace más de dos décadas, el aumento
incesante de las resistencias y los avances en el conocimiento de sus
mecanismos moleculares han condicionado que exista una gran cantidad de
información en la literatura sobre cada uno de los componentes de esta familia de
antibióticos.(1) La presencia de un anillo betalactámico define químicamente a
esta familia de antibióticos, de la que se han originado diversos grupos:
penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactamas e inhibidores de las
betalactamasas. (1)
En el presente trabajo, se hará referencia a las cefalosporinas en especial,
antibióticos beta lactamicos de gran importancia económica, se abordaran temas
como su clasificación, estructura química, mecanismos de acción, biosíntesis, tipo
de fermentación utilizado para su fabricación, así como el sustrato utilizado,
características del medio, parámetros termodinámicos, a la vez que también se
comentara su importancia económica y se hablara de las empresas que lo
producen.
Cabe mencionar que este tema ha sido seleccionado debido, a que, además de
ser de interés personal, la industria farmacéutica es una de las más importantes a
nivel mundial, debido a su capacidad económica, interés social, además de que
varios de los grandes avances científicos que se han venido dando, surgieron en
este ramo en particular.
El descubrimiento de las cefalosporinas se debe a Giuseppe Brotzu, en la
Universidad de Cagliarí (Cerdeña, Italia).Brotzu trabajó con la hipótesis de que en
la autodepuración del agua debían existir microorganismos capaces de inhibir el
crecimiento de gérmenes patógenos. En 1948, Brotzu, aisló por vez primera una
cefalosporina a partir del hongo Cephalosporium acrenmonium. Los líquidos
donde se cultivaba este hongo contenía tres tipos de antibióticos definidos:
cefalosporina P, activa únicamente contra microorganismos grampositivos,
cefalosporina N, una estructura con la cadena lateral derivada del acido D-
alfaminoadipico, efectiva frente a bacterias gramnegativas y grampositivas y la
cefalosporina C menos potente que la cefalosporina N pero con igual gama de
efectividad.(2) después de experimentos preliminares con Cephalosporium
acremonium (CM 49137) por hetley en Oxford, el hongo fue crecido a gran escala
en un laboratorio de investigación en Clevendon, los cultivos en caldo fueron
transportados a Oxford para su estudio. El primer antibiótico que se detecto, se le
llamo cefalosporina P, eso fue por que mostraba actividad contra algunas cepas
bacterianas gram positivas, fue purificada por Burton y Abraham en 1951. Se
demostró que la cefalosporina P es un acido mono carboxílico perteneciente al
grupo de los triterpenos tetraciclicos está relacionada estructuralmente con el
acido helvolico ya conocido con anterioridad pero menos efectivo y más potente
que el acido fusidico que se encontró que tenia usos limitados en la práctica
clínica. Muestra una protección limitada en ratón contra infecciones
estafilocócicas. La cefalosporina P es solo activa contra algunas especies de
bacterias gram positivas, esto mostro que por sí sola no tenía el amplio espectro
que Brotzu señalo. En la fase acuosa resultante de la extracción por solventes, fue
4


encontrada la cefalosporina N, la llamaron así por que muestra actividad contra
bacterias gran negativa, particularmente contra cepas de salmonella thypi, así
como contra estafilococos sensibles a penicilina. Sin duda esta era la sustancia
que Brotzu había dado a conocer. Las cefalosporina N que es hidrofilica es
inactivada por preparaciones crudas de penicilinas de Bacillus cereus. Se aisló
semi-pura y se demostró que era una nueva penicilina con una unión δ de la
cadena lateral de –α-aminoadipil en lugar de la cadena lateral fenilacetil
(C6H5CH2CO) de la benzilpenicilina.(8) Con filtrados impuros de cultivo liquido
realizó pruebas clínicas con éxito en infecciones experimentales. En 1948 publicó
su trabajo en una revista sin proyección internacional, haciendo constar el deseo
de que su labor continuase en centros mejor dotados. Su hallazgo posiblemente
hubiera quedado olvidado sin la intervención de Blyth Brook, quien durante la 2~
Guerra Mundial había sido oficial de Salud Pública en Cerdeña. Brook dio cuenta
de aquellos resultados al equipo que había purificado la penicilina en la
Universidad de Oxford. Brotzu envió la cepa a Inglaterra y años más tarde, en
1955, se estableció la estructura del antibiótico beta-lactámico cefalosporina.(3)
En esta monografía se hablara específicamente de las cefalosporinas C, ya que
de su derivado 7-ACA se obtienen la mayoria de las cefalosporinas semisinteticas
de importancia comercial. Las cefalosporinas C están constituidas por un anillo
beta- lactámico, que caracteriza a todos los antibióticos de este tipo; y un anillo de
dihidrotiazina, en lugar de tiazolidina, que las distingue de las penicilinas. La
cefalosporina C tiene poco poder antibiótico y por vía química se transforma en
ácido 7aminocefalosporanico (7-ACA), punto de partida de toda una serie de
cefalosporinas semisintéticas. La diferencia entre las cefalosporinas se debe a los
grupos sustituyentes de los carbonos 3 y 7. (3) Las modificaciones en la posición 7
están asociadas a cambios en las propiedades antibacterianas y las sustituciones
en la posición 3 del anillo dihidrotiazinico se asocian a cambios en el metabolismo
y a la farmacocinética del medicamento. (2)
Estos compuestos con diferencias en sus cadenas laterales han sido clasificados
por generaciones.

CEFALOSPORINAS
Las cefalosporinas son antibióticos β-lactámicos modernos cuyas características
bactericidas le ofrecen al médico y a los pacientes diversas ventajas: pocos
efectos adversos, la habilidad de adaptar el tratamiento para combatir infecciones
de microorganismos grampositivos, infecciones mixtas, o infecciones por
microorganismos anaerobios; la disponibilidad de formas de administración oral,
tópicas e inyectables; y una elección entre agentes de acción corta o prolongada,
dependiendo de la naturaleza de la infección bacteriana, incluyendo cepas
bacterianas resistentes a los antibióticos existentes. (4)

5


ESTRUCTURA
Los estudios estructurales acerca de la CPC fueron considerablemente facilitados
por el conocimiento previo de las propiedades de las penicilinas. Como la
penicilina N, la CPC se
Comportaba como un ácido monoaminodicarboxílico y contenía un residuo δ-D-α-
aminoadipilico unido al resto de la molécula a través de su grupo δ-carboxílico. El
espectro de absorción infrarroja de su sal sódica mostraba una banda fuerte a
-1
1782 cm característica del carbonilo β-lactámico y similar a la frecuencia de
extensión del correspondiente carbonilo en las penicilinas. A pesar de estas
similitudes, la CPC mostraba algunas diferencias marcadas con la penicilina N. En
la hidrólisis ácida, no producía D-penicilamina, sino producía un número de
fragmentos sulfurados que carecían de nitrógeno. Estos y otros resultados no eran
consistentes con la presencia de un sistema de anillos β-lactamicos-tiazolidinicos
fundidos, y en esta etapa fue propuesta la estructura que contenía el sistema de
anillos dihidrotiazínicos. Esta estructura mostró ser consistente con las
propiedades químicas y físicas de la CPC conocidas y subsecuentemente fue
confirmada por cristalografía de rayos X. Como se esperaba, la inestabilidad del
anillo β-lactámico en condiciones básicas acoplada a la presencia de otros sitios
reactivos resultaba en la completa degradación de la molécula a pH alto. (4)
Durante la purificación de la CPC en buffer de acetato de piridina, se
observó la formación de una betaína de piridinio. Esta reacción mostró ser una
reacción general con una variedad de bases heterocíclicas débiles y
posteriormente se le encontró una aplicación extensiva en la producción de
cefalosporinas semisintéticas.(4)

ESTRUCTURA QUIMICA DE LA CEFALOSPORINA C(4)

En esta imagen se pueden observar los carbonos 3 y 7, lugares donde ocurre la
sustitución de compuestos, responsables de las distintas generaciones de
cefalosporinas.

6


TABLA 1 Estructuras de cefalosporinas y cefamicinas (6)

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CLASIFICACION
A partir de la cefalosporina C se obtiene el ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA),
que ha sido modificado con diferentes cadenas laterales, dando lugar a tres
generaciones bien diferenciadas y a una cuarta que se está iniciando en la
actualidad. Las variaciones introducidas en C7 del 7-ACA modifican su actividad
antibacteriana, la sustitución en posición 3 del anillo dihidrotiazínico origina
modificaciones de carácter farmacocinético, y la presencia del grupo
metiltiotetrazol en la posición 3 del anillo dihidrotiazolidínico está relacionado con
efectos adversos concretos: alteraciones de la coagulación e intolerancia al
alcohol. Las moléculas con un grupo metoxi en posición 7 del 7-ACA constituyen
el grupo de las cefamicinas, que la mayoría de los autores no han reconocido
como independiente. Se está ensayando producir cefalosporinas con efecto
antibacteriano dual, las cuales resultan químicamente estables y han demostrado
tener una gran actividad contra un amplio número de bacterias gram-positivas y
gram-negativas. Estas cefalosporinas de acción dual se crean enlazando
quinolonas a la posición 3’ de la cefalosporinas a través de un enlace ester, a una
función carbonato o a una unión a través de un nitrógeno cuaternario.(5)

Generaciones de Cefalosporinas:

Las cefalosporinas de primera generación son para administración oral y
parenteral. Las orales son llamadas fenilglicinas o derivados hidroxifenilglicinas
que incluyen la cefalexina, cefadroxilo y cefradina; entre las parenterales se
cuenta con la cefalotina, cefazolina, cefradina (administración oral también) y
cefapirina. Este grupo de antibacterianos incluye sustitutos de la penicilina G que
son resistentes a las penicilinasas de los Staphylococcus, por tanto tienen una
buena actividad contra bacterias aerobias gram-positivas (con excepción de
Enterococos, Staphylococcus resistentes a la meticilina, Staphilococcus
epidermidis y pneumococos resistentes a penicilina), y algunos organismos gram-
negativos adquiridos en la comunidad (P. mirabilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae
y Moraxella catarrhalis).(5)

Las cefalosporinas de segunda generación ofrecen una cobertura mayor frente
a los bacilos gramnegativos que las de primera generación. Todas estas
cefalosporinas tienen actividad contra la mayoría de los microorganismos
destruidos por agentes de la primera generación, pero su cobertura es más
extensa ya que incrementan su actividad contra microorganismos gram-negativos,
en especial tres: Haemophilus influenzae y Neisseria sp. Existe un subgrupo entre
estos agentes, los cuales son cefoxitina -es la más potente del sub-grupo-
cefotetan y cefmetazole que son activos contra el grupo de B. fragilis. Con
excepción de la cefuroxima, las cefalosporinas de segunda generación no deben
administrarse en meningitis. Estas, al igual que las de primera generación se
dividen en orales y parenterales. Las primeras son llamadas también ésteres-
prodrogas e incluyen al Loracarbef (que a pesar de ser una droga fenilglicina, se
puede clasificar como de segunda generación por sus propiedades
antibacterianas), cefaclor, cefuroxime axetil y cefprozil. Las segundas son el
8


cefamandol, cefonicid, cefoxitina, ceforinida, cefuroxime, cefotetan y el
cefmetazole.(5)

Las cefalosporinas de tercera generación suelen resultar más eficaces in vitro
frente a los bacilos gramnegativos y frente a los cocos grampositivos (excepto S.
Aureus) que los fármacos de primera y segunda generaciones. Las cefalosporinas
de tercera generación son el tratamiento de elección en la meningitis por bacilos
gramnegativos y se utilizan también para combatir otras infecciones por bacilos
gramnegativos. Todo este grupo de tercera generación son extremadamente
activas contra la mayoría de las bacterias gram-negativas (excepto Enterobacter y
Citrobacter) incluyendo las mencionadas anteriormente, es decir, las
Enterobacteriaceae y otros organismos entéricos y Serratia marcescens, y
también contra bacterias productoras de Beta-lactamasas. La ceftazidime y el
cefoperazone son activas contra Pseudomonas aeruginosa, pero son menos
activas que otros agentes de tercera generación contra cocos gram-positivos.
Estos antibióticos no están indicados en la profilaxis quirúrgica de rutina. Al igual
que en los grupos anteriores hay parenterales y orales. Cefixime, cefdinir,
cefpodoxima proxetil y ceftibuten son las orales y cefoperazone, ceftazidime,
moxalactam, cefotaxime, ceftizoxime, cefmenoxime y ceftriaxone son parenterales.
Las últimas cinco son aminotiazolil-iminometoxi-cefalosporinas.(5)

Las cefalosporinas de cuarta generación de incluyen el cefepime y el cefpirone -
ambas de administración parenteral- tienen un extenso espectro de acción
comparadas con las de tercera generación y tienen una gran estabilidad contra
Beta-lactamasas mediadas cromosomalmente y por plásmidos, además de poca o
ninguna capacidad para inducir la producción de Beta-lactamasas tipo I. Cubren
Enterobacter y Citrobacter y tiene particular uso terapéutico en el tratamiento de
infecciones debidas a bacilos aerobios gram-negativos resistentes a
cefalosporinas de tercera generación con lo cual se logra su erradicación y tienen
mejor actividad contra algunos gram-positivos.(5)

Actualmente se encuentran en estudio un nuevo grupo de cefalosporinas
inyectables, las cuales incluyen el cefozopran, cefpiramide, E 1100, FK 037 y DQ-
2556. Esta última ha resultado más activa que el cefepime pero menos activa que
el cefpirone contra bacterias gram-positivas, además de ser el compuesto más
activo contra los miembros de las Enterobacteriaceae. (5)

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TABLA 2

MECANISMOS DE ACCION

Las cefalosporinas pueden llegar a matar a las bacterias susceptibles y aunque su
mecanismo de acción aún no se conoce completamente, existen conocimientos
que permiten conocer el fenómeno básico. (7)

Las paredes celulares de las bacterias son esenciales para su crecimiento y
desarrollo y el peptidoglicán es un componente heteropolimérico de dicha pared
que asegura estabilidad mecánica rígida en virtud de su estructura de enrejado
con abundantes uniones cruzadas, las cuales tienen características individuales
para cada microorganismo; la biosíntesis del peptidoglicán involucra unas 30
enzimas y pueden considerarse 3 etapas, la tercera etapa o etapa de
transpeptidación es la que ocurre por fuera de la membrana celular y produce el
entrecruzamiento completo entre las 2 cadenas donde actúan los betalactámicos,

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e inhiben la enzima transpeptidasa encargada de este proceso y que inician los
eventos que llevan a la lisis y muerte bacteriana.(7)

Recientemente se han revelado en la membrana citoplasmática de las bacterias,
múltiples proteínas, a las cuales se unen los betalactámicos específicamente por
enlaces covalentes, éstas se han dominado proteínas de unión a las penicillinas;
varían de una especie bacteriana a otra y se clasifican de acuerdo con su número
y peso molecular. Algunas de ellas parecen tener actividad transpeptidasa. Se
han observado cambios morfológicos, tales como la formación de esferoblastos
osmóticamente estables, protoblastos y formas filamentosas no tabicadas donde
se encuentra inhibida la división celular inducida por betalactámicos. (7)

Hay tres mecanismos de resistencia frente a los antibióticos B-lactámicos: menor
permeabilidad, mutaciones en las PBPs o ruptura enzimática por 13—lactamasas.
Las cefalosporinas son resistentes a algunos tipos de 5—lactainasas a las que las
penicilinas son sensibles.(3)

Su eficacia se relaciona más con el tiempo de actuación que con la concentración
en el medio activo, son bactericidas de efecto lento sólo en fase de crecimiento
bacteriano. Su efecto bactericida máximo es a concentraciones 4 veces superiores
a la concentración inhibitoria mínima. El efecto posantibiótico dura
aproximadamente 2 horas frente a cocos grampositivos, y es menor o inexistente
ante los cocos gramnegativos.(7)

BIOSINTESIS DE CEFALOSPORINAS

La mayoría de los pasos implicados en la biosíntesis de las cefalosporinas
han sido caracterizados en el aspecto bioquímico, si bien muchos aspectos
relacionados con las reacciones llevadas a cabo por las diferentes enzimas se
mantienen dentro del campo de la hipótesis. Y ello a pesar de su gran interés
desde los puntos de vista médico e industrial. (4)
Estudios en los que se utilizaron extractos acelulares condujeron a la
observación de un tripéptido: el δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina o en su
forma abreviada ACV, que se forma en A. chrysogenum., al igual que en
Penicillium, por condensación de los aminoácidos L-alfa-aminoadípico, L-cisteína y
D-valina (aunque el precursor es el isómero L) a través de la enzima ACV
sintetasa codificada por el gen pcbAB. El tripéptido ACV sería posteriormente
ciclado para formar isopenicilina N debido a la acción de la enzima Isopenicilina N
sintasa que es codificada por el gen pcbC. (4)
La isopenicilina N es un intermediario que posee una cadena lateral de L-
α-aminoadipilo unida al anillo β-lactámico. (4)

Las rutas biosintéticas de cefalosporinas y cefamicinas son, hasta este punto,
similares a la de la penicilina. De hecho, el tripéptido ACV y la isopenicilina N son
intermediarios en la biosíntesis de estos tres grupos de antibióticos β-lactámicos y
en los tres casos la isopenicilina N es el resultado de la ciclación del tripéptido. A

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partir de este punto las rutas divergen en los microorganismos productores de
cefalosporinas y cefamicinas.(4)

En el caso de A. chrysogenum la isopenicilina N es convertida en penicilina
N por un sistema de dos proteínas: la codificada por el gen cefD1, que muestra
una alta similitud a las acil CoA sintetasas de cadena larga; y la codificada por el
gen cefD2, el cual muestra una alta similitud a las acil CoA racemasas. La
transformación final a penicilina N requiere también una hidrólisis del CoA tioester
la cual ha sido reportada ocurre en forma no estereoespecífica a través de
diferentes tioestearasas. (4)

La penicilina N es transformada en desacetoxicefalosporina C por medio de una
enzima que convierte el anillo tiazolidínico de cinco miembros característico de las
penicilinas en un anillo dihidrotiazínico de seis miembros (típico de cefalosporinas
y cefamicinas). La desacetoxicefalosporina C es posteriormente hidroxilada,
formándose desacetilcefalosporina C. En A. chrysogenum las actividades de
expansión del anillo y posterior hidroxilación se encuentran asociadas en una
única proteína: la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa, codificada por el gen cefEF,
mientras que en los microorganismos productores de cefamicina se localizan en
enzimas separadas codificadas por genes separados. El último paso de la ruta de
biosíntesis de cefalosporina es la acetilación de la desacetilcefalosporina C a
cefalosporina C paso catalizado por el producto del gen cefG: la Acetil CoA DAC
acetiltransferasa. (4)

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TABLA 3 Ruta de Biosintesis de la Cefalosporina, cuadro tomado de la referencia
(4)

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- Mecanismos de regulación de la biosíntesis de CPC

Los estudios sobre la regulación de la biosíntesis de antibióticos β-lactámicos son
útiles para mejorar los procesos de fermentación. La producción de antibióticos β-
lactámicos tiene lugar mejor bajo condiciones de desequilibrio de nutrientes y a
velocidades de crecimiento bajas. Además existen factores ambientales como el
pH y el nivel de oxígeno que afectan el crecimiento microbiano y la formación de
productos. (4)

Regulación por la fuente de carbono

Diferentes fuentes de carbono ejercen marcados efectos sobre la producción de
CPC. Concretamente, las fuentes de carbono que proporcionan un rápido
crecimiento (glucosa, glicerol, maltosa) ejercen un efecto negativo en la
producción de β-lactamas. Ya se han estudiado los pasos de la biosíntesis de
CPC y, en particular los mecanismos involucrados, que son afectados por
represión por glucosa. En Acremonium chrysogenum, los resultados obtenidos del
análisis de la actividad enzimática en cultivos en crecimiento y/o en micelio en
suspensión indicaron que la ACV sintetasa está sujeta a inhibición por carbono.
(4)

Otras enzimas examinadas, tales como la isopenicilina N sintasa y la DAOC
sintetasa/DAC hidroxilasa, parecen estar inhibidas a nivel de la síntesis de novo, lo
cual implica represión transcripcional o traduccional. Estudios realizados por
Jekosh y Kück (2000) acerca de la fisiología molecular del gen pcbC que codifica
para la isopenicilina N sintasa, indican represión transcripcional del gen por
glucosa en una cepa silvestre de A. chrysogenum, sin observarse algún evento
regulador a nivel traduccional. Por otro lado, en una cepa de A. chrysogenum
mejorada en cuanto al nivel de producción de CPC (A3/2), no se observó la
represión del gen pcbC observada en la cepa silvestre. Similarmente, Shen y col.
(1986) notaron una reducida actividad isopenicilina N sintasa en una cepa silvestre
diferente en presencia de glucosa, mientras que no observaron cambios en esta
actividad en otra cepa productora (C10). Estas observaciones los llevan a la
conclusión de que el mejoramiento genético en A. chrysogenum está
correlacionado con una reducida respuesta de la expresión del gen pcbC a la
glucosa. (4)

La investigación de Jekosh y Kück (2000) también apoya la hipótesis de que la
expresión del gen cefEF que codifica para la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa es
el principal blanco de la regulación por glucosa, a través de la represión de la
síntesis de novo y de la misma forma en que se observa para la isopenicilina N
sintasa. (4)

La represión ejercida por la fuente de carbono también es importante en las
fermentaciones de C. acremonium, con respecto a la degradación no deseable de
la cefalosporina C por la acetilhidrolasa (Hinnen y Nüesch, 1976). Esta enzima es

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producida tardíamente en la fermentación y es reprimida por glucosa, maltosa y
sacarosa, pero no por glicerol ni succinato. (4)

Regulación por la fuente de nitrógeno

La formación de antibióticos β-lactámicos por A. chrysogenum (Shen y col., 1984)
y por P. chrysogenum está fuertemente regulada por la fuente de nitrógeno
usada, siendo los iones amonio los que muestran el efecto negativo más fuerte, no
debiéndose este efecto a su esqueleto carbonado.

Concentraciones de amonio superiores a 110 mM interfieren fuertemente en la
+
producción de CPC por A. chrysogenum. La adición de NH reprime la DAOC
4
sintetasa/DAC hidroxilasa pero no la IPN sintasa (ciclasa). La represión de la
expandasa (DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa) es paralela a altos niveles de
amonio en el caldo de cultivo durante la fermentación. La L-asparagina y la L-
arginina son mejores fuentes de nitrógeno que el amonio para la producción de
antibióticos. (4)

Aminoácidos como precursores y mediadores de la regulación

Penicillium y Acremonium requieren determinadas fuentes de azufre para la
producción óptima de sus respectivos antibióticos beta-lactámicos. Para la síntesis
eficaz de cefalosporinas, Acremonium chrysogenum obtiene este azufre a partir de
la metionina por transulfuración inversa. (4)

Los organismos productores de antibióticos beta-lactámicos pueden utilizar la
metionina como única fuente de nitrógeno y azufre. En adición, si se añade
durante la fase de crecimiento vegetativo de Acremonium chrysogenum, este
aminoácido ejerce un importante efecto estimulador sobre la producción de
cefalosporinas. A través de diferentes investigaciones para dilucidar el papel de la
metionina en la síntesis de CPC se ha podido concluir que este aminoácido no es
solamente un precursor de la síntesis de cefalosporina, sino que también es
inductor de ésta. (4)

En las cepas protótrofas de Acremonium chrysogenum la síntesis de antibiótico no
es inhibida por adición de lisina exógena ni promovida por el ácido alfa-
aminoadípico. Sin embargo, esto se debe a la impermeabilidad y no a la falta de
sensibilidad a estos aminoácidos. Así, los auxótrofos de lisina bloqueados
después del alfa-aminoadípico son capaces de crecer bien cuando se añade lisina
al caldo y, si la concentración de este aminoácido es excesiva, se paraliza la
formación de cefalosporinas por inhibición de la homocitrato sintetasa. (4)

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También es interesante reseñar que en ciertos mutantes de Acremonium
altamente productores, la actividad específica de la enzima glutamato
deshidrogenasa está desreprimida mientras que en los mutantes de baja
producción esta actividad enzimática está reprimida. La alteración de la regulación
de la glutamato deshidrogenasa puede aumentar la asimilación del nitrógeno
favoreciendo así la síntesis de CPC. (4)

Regulación por fosfato

Se encontró que un exceso de fosfato ejercía un efecto negativo en la producción
de CPC por A. chrysogenum W5325. Las bases de este efecto todavía son
materia de debate, y el mecanismo molecular todavía no se comprende. Se
sugería que el fosfato incrementaba la velocidad de consumo de glucosa,
incrementando así la represión por glucosa, mientras que experimentos con
micelio en suspensión indicaron que en ausencia de glucosa, el fosfato mismo
disminuía el flujo completo para la formación de CPC (Martín y col., 1982). Esto
fue posteriormente apoyado por Zhang y col. (1988), quienes encontraron un
efecto negativo directo del fosfato en la formación de varias enzimas (ACVS,
IPNS, y DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa) de la ruta de biosíntesis de
cefalosporina. Se sugirió que el fosfato actuaba sobre la IPNS y la DAOC
sintetasa/DAC hidroxilasa a través de la formación de un complejo con el hierro,
necesario para la actividad enzimática, porque la inhibición de estas dos enzimas
podía ser revertida a través de la adición de hierro en forma de sal ferrosa. Sin
embargo, aún la inhibición de la ACVS, que no requiere hierro en forma de sal
2+.
ferrosa para su actividad, era revertida por Fe Por lo tanto la causa del efecto
inhibitorio del fosfato todavía no está completamente entendida. (4)

Regulación por pH ambiental

Para determinar el efecto del pH en la expresión de los genes de biosíntesis de
CPC en A. chrysogenum, Schmitt y col. (2001) analizaron los niveles de
transcripción en cultivos en crecimiento en medio amortiguado entre valores de pH
de 5 y 8. El análisis de ARN total en dos cepas de Acremoniun mostraron que: en
la cepa silvestre ATCC 14553 el gen pcbC (que codifica para la proteína IPNS) es
expresado a niveles apreciables solamente por encima de pH 5, mientras que el
transcrito del gen cefEF (que codifica para la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa) no
es detectable por hibridación de Northern aún a pH 8. En contraste con esto, la
cepa semiproductora A3/2 expresa ambos transcritos sobre el intervalo completo
de pH estudiado. Los niveles más altos de trascripción fueron observados para
cultivos creciendo entre pH 6 y pH 7. (4)

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En hongos filamentosos el factor de transcripción PACC es importante para la
expresión génica en respuesta al pH del ambiente. El estudio de Schmitt y col.
(2001) caracterizó el gen pacC de A. chrysogenum, mostrando que su proteína
PACC se unía a todas las secuencias consenso PACC que están presentes en las
dos regiones intergénicas conocidas de los genes de biosíntesis de CPC. (4)

TABLA 4 EFECTOS DE Ph EN PRODUCCION

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Efecto del oxígeno en el sistema respiratorio y en la producción de CPC

La velocidad completa de la síntesis de CPC es severamente reducida en
condiciones de concentración baja de oxígeno. La reducción en la provisión de
oxígeno lleva a la acumulación de penicilina N, un precursor de la CPC. El
mecanismo de control del oxígeno sobre la síntesis de CPC no está
completamente comprendido. Posiblemente, los bajos niveles de oxígeno afectan
directamente a la ruta biosintética de la CPC, la cual incluye tres reacciones de
oxidación. También es posible que un metabolismo completo más eficiente
provisto por niveles más altos de oxígeno, indirectamente resulte en niveles
mayores de producción de CPC. Una revisión de Sandor y col. (2003) indica que
A. chrysogenum posee una ruta respiratoria en su mitocondria resistente al
cianuro, que se vale de una llamada oxidasa alternativa (AOX) para realizar su
funcionamiento. Esta AOX responde de manera primaria a procesos que
involucran la generación de especies que contienen oxígeno reactivo (ROS),
incluyendo el incremento de aireación, el catabolismo de ciertas fuentes de
carbono y el envejecimiento. Se probó que la actividad de la AOX juega un papel
crucial en la sobreproducción de CPC a través de la remoción de equivalentes
reductores, permitiendo así que el catabolismo del carbono proceda. Bajo
condiciones no productoras, esta relación se pierde. Sin embargo, una inhibición
de la generación de ROS resultaría inevitablemente en la disminución de la
actividad de la AOX y subsecuentemente en una producción de CPC reducida,
independientemente de la tecnología de producción utilizada.

PRODUCCION DE CEFALOSPORINAS

Las cefalosporinas se pueden obtener directamente por fermentación o también
por desasilacion enzimática hasta formar el acido 7-amino-afalosporanico (7-ACA)
seguido de acilacion para introducir la cadena lateral deseada. Por otra parte, los
anillos de 5 atomos de las penicilinas pueden alargarse químicamente a 6
obtendiendo el anillo dihidrotiazina de las cefalosporinas y la cadena lateral puede
eliminarse enzimáticamente sin necesidad de proteger los grupos reactivos. (9)

Como ejeplo, Toyo Jozo Co. Eplea una enzima desasilante de Bacillus
megaterium para producir acido 7-aino-desaseloxi-cefalosporanico (7-ADCA) a
partir de fenilacetil-7-ADCA. La enzima esta absorbido en celita en un reactor
columna empaquetado obteniéndose un rendimiento del 85%. También se ha
utilizado una enzima similar obtenida de Proteus rattgeri con un rendimiento del
90%. Abbot y Berry emplearon una enzima de Streptoyces capillispira para
desesterificar esteres etílicos de las cefalosporinas. (9)

En todas las reacciones se acumulan preferentemente los productos estables
termodinámicamente; sin embargo, como todas las reacciones son reversibles a
nivel microscópico, si seleccionan las condiciones apropiadas se pueden producir
la reacción inversa. Por ejemplo la enzima inmovilizada de B. metaterium puede
emplearse para la reacción inversa, la acilacion de 7-ADCA a 7-ACA. (9)

18


Producción de antibióticos

Una cepa de alta producción es un prerrequisito esencial en cualquier proceso de
producción de antibióticos. Una vez se consigue esto es de la mayor importancia
retener las características y la viabilidad de la cepa durante largos periodos de
almacenamiento.

El cultivo conservado es una propiedad valiosa y como tal debe ser utilizado tan
moderadamente como sea posible. Por tanto es poco deseable inocular
directamente un gran fermentador con las grandes cantidades de material
conservado que sería necesario para asegurar el desarrollo satisfactorio.
Generalmente se toman las cantidades más pequeñas se amplifica mediante
crecimiento sobre superficies solidas o en medio liquido el inoculo resultante se
encuentran generalmente en la forma de una suspensión preparadas con varios
días de antelación.

Para optimizar la productividad del fermentador final generalmente se lleva a cabo
parte de la fase de crecimiento en un fermentador de inoculo separado. Producir la
cantidad máxima de biomasa en un estado metabólico adecuado para conseguir
un rápido arranque de la etapa final.

IMAGEN 6

19


Los antibióticos son metabolitos secundarios; por consiguiente para conseguir la
productividad máxima es necesario limitar este crecimiento y encauzar el
organismo hacia el metabolismo secundario. Esto se lleva a cabo generalmente
diseñando el medio de forma que un nutriente clave sea consumido en el
momento apropiado, la elección del nutriente limitante es importante.

En muchas fermentaciones de hongos y estreptomicetos se opera un proceso de
alimentación discontinua en el que la fase de producción se extiende alimentando
nutrientes a lo largo de la fermentación. En lo que se conoce, ningún antibiótico se
produce comercialmente por cultivo continuo, aunque este procedimiento es
utilizado extensamente para el trabajo experimental en la industria.

TABLA 7

El antibiótico es solo un componente menor del medio completo (entre 3 y 35 % de
los solutos totales en el caldo). La etapa inicial en su recuperación y purificación
es generalmente la separación de los microorganismos de la fase liquida por
filtración o centrifugación. Las técnicas de procesamiento utilizados para el
aislamiento y la purificación de los antibióticos pueden incluir la extracción con
solventes, el intercambio iónico, la ultrafiltración, la osmosis reversa, la
precipitación y la cristalización. Finalmente la masa del producto se seca se utiliza
para la preparación de derivados o para la fabricación de preparaciones
farmacéuticas.

Las vasijas (para la preparación del medio) y los esterilizadores no son esenciales
para la operación, puesto que el medio puede prepararse y esterilizarse en el
propio fermentador.
20


El esterilizador puede ser un esterilizador discontinuo o un esterilizador continuo.
Los esterilizadores continuos producían menor daño en el medio, se requiere
menos energía para esterilizar un volumen equivalente de medio.

Las vasijas de alimentación que se utilizan para suministrar nutrientes o materiales
precursores durante el curso de la fermentación. La recuperación de los
antibióticos requiere la separación del organismo, lo que se lleva acabo utilizando
un filtro o una centrifuga. Un proceso de recuperación eficiente es tan esencial
como un proceso de fermentación eficiente.

21


IMAGEN 8

22


23


La vasija mas importante es el propio fermentador final. Existe un conjunto de
criterios que deben cumplirse cuando se diseña un fermentador. Debe tener tanto
una alta transferencia de masa gas/liquido, para asegurar un suministro adecuado
de oxigeno, como una alta transferencia de nutrientes en la interface para
asegurar que los nutrientes sean distribuidos y suministrados rápidamente al
organismo. Debe tener buenas características de mezclado de la masa para
asegurar la homogeneidad dentro de la vasija. Por consiguiente deben ser buenos
cambiadores de calor.

IMAGEN 9

Las fermentaciones comerciales de antibióticos se lleva a cabo en fermentadores
de diseño tradicional capaces de mantener entre 30 y 200 metros cúbicos de
liquido.la altura de las vasijas es de entre 2 y 4 veces el diámetro y se adaptan a
las paredes del recipiente un numero de cortacorrientes verticales (4-6) de
aproximadamente 1/10 del diámetro de la vasija.

24


La agitación del caldo se realiza mediante una serie de paletas de hoja plana
(Rushton). Para mejorar las características de mezclado de la masa, las paletas
superiores pueden ser de tipo marino, de hojas oblicuas o de diseño patentado,
por ejemplo la paleta Sabre.

El calor generado debe ser eliminado rápidamente a su temperatura optima,
típicamente 24-26°C. el calor producido se elimina mediante agua de refrigeración.
El agua se recirculariza a través de un sistema de torres de enfriamiento que
reduce su temperatura a entre 15 y 20 °C. Utilizando agua as esta temperatura es
posible enfriar fermentaciones de hasta aproximadamente 100 metros cuadrados
mediante una camisa o una espiral externa estrechamente adosada. Para
volúmenes mas grandes el aire disponible para transferir calor es insuficiente a
menos que se utilice agua refrigerada (4-8 °C) o salmuera refrigerada (0-4 °C).

Mantener el fermentador por encima de la presión atmosférica tiene la doble
ventaja de impedir la entrada de organismos contaminantes desde el exterior y de
aumentar el potencial transferencia de oxigeno al interior del sistema.

Los fermentadores tienen adaptadas puertas que permitan la entrada de varias
sondas, tradicionalmente para medida del pH y detección del nivel de espuma.

Algunas fermentaciones de antibióticos requieren la adición de substancias a lo
largo del proceso. El método establecido durante mucho tiempo es la adición vía
un sistema bureta que se llena hasta un nivel establecido de volumen y descarga
a la vasija a tiempos determinados. Aunque es adecuado para alimentar
nutrientes, no es completamente satisfactorio cuando se utiliza para añadir ácidos
o álcalis para el control del pH. (11)

FERMENTACION

Cepas de alto rendimiento de A. chrysogenum se utilizan en gran escala, en
fermentaciones fed-batch. Los principales productores por fermentación de C
cefalosporina obtienen rendimientos en el rango de 20-25 g / l. las fermentaciones
a escala de producción utilizan como fuente de carbono carbohidratos simples o
complejos que son incorporados al medio durante la fase de crecimiento.
Conforme avanza la fermentación la alimentación de azucares se reduce y son
generalmente reemplazadas por aceites de mayor energía tales como aceite de
soja o el aceite de maní. La conservación de energía apartir de aceite como
sustrato como sustrato es considerablemente menos eficiente y conduce a un
crecimiento más lento, del micelio vegetativo. (10)

25


Cultivos en medio líquidos
Los trabajos más recientes que reportan la producción de CPC por cultivos
de Acremonium chrysogenum C10 (ATCC 48272) utilizan medios que contienen
dos fuentes de carbono, glucosa y sacarosa. El proceso de producción de CPC en
biorreactores en lote muestra dos fases distintas: durante la primera fase, una
fuente de carbono fácilmente metabolizable como la glucosa es rápidamente
consumida y es cuando se realiza la mayor parte del crecimiento; mientras que en
la segunda fase, una fuente de carbono que se consume lentamente como la
sacarosa es asimilada y la síntesis de antibiótico empieza. Este es un típico efecto
diauxico del consumo de dos carbohidratos. El lento metabolismo de la sacarosa
en la producción de CPC puede ser explicado por la baja actividad de la enzima
responsable de la hidrólisis del azúcar durante el proceso, y esto provee de
buenas condiciones para la producción de altas concentraciones de antibiótico en
procesos en lote convencionales.(4)
Algunos trabajos acerca de la producción de CPC en biorreactor en lote
reportan el mejoramiento de la producción utilizando un medio de cultivo con
glucosa y sacarosa, mientras que en otras investigaciones se trabaja con procesos
de lotes alimentados, en los que la sacarosa y la metionina se adicionan
lentamente, obteniéndose mejoras significativas. Sin embargo, la sacarosa es de
por si un azúcar lentamente metabolizable, y el mejoramiento obtenido por este
tipo de aproximaciones debería ser explicado por la adición de metionina. (4)
La información acerca de los parámetros cinéticos para la producción de
CPC es muy escasa en la literatura. Los parámetros de velocidad específica de
crecimiento y de velocidad de consumo de sustrato (μ y Y ) fueron estimados
máx. x/s
por Araujo y col. (1996) para esta misma cepa en experimentos en lote siendo los
-1
valores calculados 0.0645 h y 0.655g de biomasa/g de sustrato, en experimentos
con medio de cultivo con glucosa y sacarosa. Chu y Constantinides (1987)
presentan un valor estimado igual a 0.02217 g de biomasa/g de sustrato h y
Araujo y col. (1996) obtuvieron 0.036 g de biomasa/g de sustrato h, estos valores
se refieren al consumo de sacarosa. No es posible comparar los diferentes valores
presentados, debido a que han sido obtenidos bajo condiciones de cultivo
significativamente diferentes. (4)

En estudios más recientes, realizados con el objeto de modelar y optimizar la
producción de CPC en biorreactor alimentado, durante la fase de crecimiento
solamente se proporcionó glucosa como fuente de carbono y en la fase de
producción solamente se adicionó sacarosa hidrolizada. Se estimaron los valores
de diferentes variables del proceso y se desarrolló un modelo matemático para
representar el proceso de producción de la CPC en el lote alimentado, el cual
predice una producción de CPC máxima estimada de de aproximadamente 2300
μg/mL al final de un proceso de 5 días, lo cual es significativamente mayor a lo
obtenido mediante la fermentación en lote bajo condiciones de cultivo lo más
26


similares posible. Sin embargo, los autores no realizan ningún experimento para
confirmar esta predicción, además de que considerando las proporciones de las
dos fuentes de carbono del medio utilizado para realizar la alimentación del lote es
difícil entender como el sustrato se dirige a la producción de CPC siendo la
concentración de glucosa muy similar a la del medio inóculo donde la glucosa
tiene como principal finalidad el crecimiento y no la producción de CPC.(4)

Cultivos en medio sólidos
Wang y col. (1984) investigaron la producción de CPC en FS con arroz
como sustrato basal. Entre diferentes granos estudiados como sustrato basal, el
arroz Tsailai fue el mejor. Se determinó la mejor fórmula (Anexo 6A) para el medio
de fermentación en la base de 10 gramos de arroz y utilizando la cepa M8650-R-3
8
de Acremonium chrysogenum, con una densidad de inóculo de 2.8 X 10
esporas/g de sustrato, humedad inicial de 49-51% y temperatura de fermentación
de 25 °C. Después de 7 días de fermentación, la producción máxima de CPC fue
de 6420 μg/g de sustrato. Resulta complicado el análisis del medio de cultivo en
este caso debido a que se podría presumir una alta concentración de fuente de
carbono aprovechable del soporte (arroz Tsailai), pero no existe evidencia de la
proporción de ésta que realmente es accesible para el hongo, ya que no se
realizan mediciones de biomasa o sustrato consumido.(4)

En estudios en los que se utiliza como soporte cebada, y Acremonium
chrysogenum C10 como microorganismo productor (Jermini y Demain, 1989),
apenas se alcanza una producción máxima de 950 μg/g de sustrato después de
10 días de fermentación sólida. (4)
Otros estudios acerca de la producción de CPC empleando Acremonium
chrysogenum ATCC 48272 (cepa C-10) por cultivo en medio sólido, indican que
los mejores resultados fueron observados con 10 g de trigo crudo adicionado con
sustratos complementarios (Anexo 6B), obteniendo una producción de CPC de
22281 μg/g de sustrato después de un período de incubación de 5 días, a 30 °C,
7
inoculado con 2 X 10 esporas/g de sustrato, con una humedad del 80% y un pH
de 6.5. En este estudio también se observa la carencia de mediciones de
producción de biomasa y consumo de sustrato, por lo que no se indican tampoco
reportes acerca de la eficiencia del proceso, además de que no hay un
seguimiento cinético de este. (4)

27


SINTESIS DE CEFALOSPORINAS

Por ser el enlace Betalactámico de una elevada sensibilidad frente a ácidos y
bases, requieren todos los procesos de síntesis y semisíntesis donde esté
involucrado el anillo betalactamico la presencia de agentes que actúen activando
posiciones, grupos protectores que pueden ser eliminados fácilmente y
temperaturas de reacción tan bajas como sea posible. Estas condiciones son muy
generales para la obtención de todas las cefalosporinas.

SECUENCIA GENERAL DE SINTESIS

- Ruptura química o enzimática de la cefalosporina C a 7-ACA.

- Desplazamiento del residuo 3-acetoxi en el 7-aca con nucleófilos S Y N.

- Síntesis del ácido de la cadena lateral y si es necesario la protección de los
grupos funcionales.

- Acoplamiento del ácido con la cadena lateral con el esqueleto 7-amino cefem y si
es necesario la remoción de los grupos protectores.

- Preparación de sales estables y fisiológicamente bien toleradas.

En nuestra Empresa Farmacéutica " 8 de marzo" han sido obtenidas tres
cefalosporinas de primera generación por la vía de la síntesis química:

- Cefalexina monohidrato a escala semi-industrial .

- Cefadroxil monohidrato a escala de laboratorio.

- Cefalexina sódica escala de laboratorio.

Otras modificaciones en el anillo dihidrotiazinico y diferentes sustituciones en el
anillo B-lactámico conllevarían a la obtención de nuevas estructuras más potentes
y específicas contra bacterias resistentes a estas dos familias de las cuales les
hemos comentados en estos dos números.

La investigación para obtener antibióticos más potentes tendrán que permanecer
como una tarea permanente del desarrollo quimioterapéutico, si queremos
mantener un alto nivel en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Las
nuevas drogas tendrán que ser seleccionadas y evaluadas de acuerdo a la
eficacia, tolerancia y necesidad de acuerdo a criterios muy estrictos antes de que
sean usadas en la práctica clínica.

28


ECONOMIA

La producción de antibióticos ha sido sin duda un negocio altamente provechoso
para la industria farmacéutica en el mundo industrializado. El comercio mundial de
estos productos tiene un valor superior a los 5 millones de dólares por año y es el
segmento mas valioso del mercado farmacéutico total (unos 200 millones de
dólares). Gracias a las innovaciones tecnológicas, a medida que las ventas de
antibióticos se incrementan disminuyen sus costos de producción.

En 1992, las cefalosporinas (productos derivados de la cefalosporina C y de las
penicilinas G o V) constituyen uno de los sectores de negocios mas importantes
dentro del mercado farmacéutico global, con unas ventas de 8.3 millones de
dólares. (12)

CONCLUSION

La producción de antibióticos es una industria en vías de desarrollo sobre todo la
de las cefalosporinas ya que queda mucho por descubrir aun. Las cefalosporinas
son antibióticos muy eficaces, pero su producción por vías fermentativas aun esta
limitada ya que sus niveles de aprovechamiento son reducidos en comparación
con el de la penicilina, por lo tanto i conclusión es que vale la pena centrar la
atención en las cefalosporinas ya que son compuestos con mucho potencial tanto
por la salud como económicamente.

29


BIBLIOGRAFIA

(1) MARÍN M, ET AL. ANTIBIÓTICOS BETALACTÁMICOS
(2) LIC. ORTEGA ROLLO NANCY. PENICILINAS Y CEFALOSPORINAS. SINTEFARMA 1(2), ABRIL-JUNIO, 1995.
(3) VIAN HERRERO ALEJANDRO. CLONACIÓN DEL GEN PYR-4 DE CEPHALOSPORIUM ACREMONIUM Y SU USO EN UN VECTOR DE
TRANSFORMACIÓN, TESIS DOCTORAL, 1993. PAG 1, 2.
(4) CUADRA ZELAYA TANIA ETHEL PRODUCCIÓN DE CEFALOSPORINA C POR FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO DE
ACREMONIUM CHRYSOGENUM C10, TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN BIOTECNOLOGÍA, 2004. PAG 4.
(5) RIVAS, KB, RIVAS, MA, DAVILA, EL ET AL. CEFALOSPORINAS: DE LA PRIMERA A LA CUARTA GENERACIÓN. RFM, DIC. 2002,
VOL.25, NO.2, P.142-153. ISSN 0798-0469
(6) NDUKA OKAFOR; MODERN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY; SCIENCE PUBLISHERS; 2007. PAG. 458
(7) DR. RENÉ ZAMORA MARÍN,DR. ALEJANDRO AREU REGATEIRO,DR. JOSÉ GUNDIÁN,DR.RUBÉN MANRESA,DRA. JULIETA
SÁNCHEZ Y RAFAEL MORALES SIRGADO ; CEFALOSPORINAS; REVISTA ACTA MEDICA, 1998, VOL 8.
(8) PEREZ VARGAS SILVIA. MONOGRAFÍA CEFALOSPORINAS (REQUISITO PARA TITULO DE LICENCIATURA, QBP)
, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA, 1996, PAG. 4,
(9) A WISEMAN, MANUAL DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS ENZIMAS, EDITORIAL ACRIBIA, S.A. 1991, PAG. 363 Y 364.
(10) R.P. ELANDER.INDUSTRIAL PRODUCTION OF BETA-LACTAM ANTIBIOTICS,
(11)
(12) E. SMITH JOHN. BIOTECNOLOGIA, ED. ACRIBIA S.A. 2004. PAG 134.

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