El documento describe los métodos y técnicas de centrifugación utilizados en bioquímica. Explica las bases teóricas de la centrifugación, incluyendo la fuerza centrífuga, el campo centrífugo relativo y cómo se usa un nomograma. También describe cómo obtener suero, plasma y hematocrito mediante centrifugación diferencial y cómo aislar fracciones subcelulares usando gradientes de sacarosa o cloruro de cesio.

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Práctica 2. Centrifugación
A. Objetivos
1. Analizar las bases teóricas de la Centrifugación y la utilidad de esta herramienta para
su correcta aplicación en estudios, métodos y operaciones bioquímicos.
2. Aplicar correctamente la centrífuga clínica para la obtención de suero, plasma y % de
hematocrito.
B. Investigación previa
1. Elaborar un cuadro sinóptico con la información sobre las principales técnicas físicas,
métodos y los enfoques de estudio bioquímicos, que se indican en la siguiente
bibliografía: Murray, K. R. et al., 2001. Biomoléculas y métodos bioquímicos. Cap. 2,
páginas 9-14, cuadros 2-5, 2-6 y 2-7 y las figuras 2-2 y 2-3.
2. Elaborar un cuadro-resumen con información sobre la estructura y modo de acción de
los anticoagulantes más utilizados (Sugerencias: i)
http://labbioq.blogspot.mx/2010/10/anticoagulantes.html , ii) Coles, 1989 y iii)
Benjamin, 1991).
3. Investigar los valores normales o de referencia de hematocrito en las siguientes
especies animales: bovinos, ovinos, pollos y cerdos y el hombre.
4. Investigar casos en animales, en los que se presenta alteración del hematocrito.
5. Definir las siguientes palabras clave: sobrenadante, tipos de centrifugación, rotor,
centrifugación diferencial, sedimentación, coeficiente de sedimentación, nomograma,
obtenidas a partir de la información contenida en el documento ubicado en el siguiente
sitio: a) Biología celular. Módulo 1, Sección 1.3.2. Disponible en
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/progr
amacell.htm . Recuperado el 17 de enero de 2016.

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C. Introducción
La Bioquímica es una disciplina experimental que pretende describir la estructura,
organización y funciones de las moléculas que forman a los seres vivos, así como los
procesos que dirigen su degradación y síntesis, en este sentido la Centrifugación es una
herramienta muy útil, pues permite separar células, organelos y biomoléculas, en virtud
de sus diferentes tamaños, pesos e inclusive formas, al someterlas a determinadas fuerza
de gravedad y velocidad relativamente altas.
El campo centrífugo (G), es la fuerza responsable del empuje que del centro a la periferia
experimentan los cuerpos que se mueven en una trayectoria circular, lo que ocasiona que
un determinado peso sea desplazado en dirección radial hacia fuera y sedimente. G está
determinado por la velocidad angular (w, rad s-1
) del rotor y la distancia radial (r, cm) de
la partícula al eje de rotación, de acuerdo a la ecuación 1:
rwG 2
 (1)
Si en la ecuación (1) se sustituye el valor de velocidad angular del rotor (w) en
revoluciones por minuto (rpm), [
60
2 rpm
w

 ], queda la ecuación (2):
(2)
rrpmx
rmpr
FCR 25
22
)(1011.1
)980)(3600(
.)..(4
... 


(3)
3600
)(4 22
rrpm
G


El campo centrífugo (G) es expresado generalmente en
múltiplos de la aceleración de la gravedad (g, 980 cm s-2
) y se
conoce como Campo Centrífugo Relativo (RCF), que se
expresa en la ecuación (3).
( 3 )
Si en la ecuación (3) se sustituye el valor de , el RCF se
obtiene multiplicando el valor 1.11 x 10-5
por la velocidad de
centrifugación al cuadrado y por el radio del rotor (r), (Ec. 4).
RCF= 1.11 x 10-5
(rpm)2
r (4)
De tal forma que si consideramos una velocidad del rotor de 10
000 rev min-1
y el radio de rotación o distancia radial “r” como
5 cm, entonces al sustituir en la ecuación 4, queda que el RCF
es 5 550 veces la aceleración de la gravedad (5 550 g).

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Nomograma
Las gráficas denominadas nomogramas, son recursos que permiten calcular el RFC,
combinando tres variables en forma de columna, de manera que relacionando dos de
ellas, es posible conocer la tercera. El nomograma utilizado en la centrifugación (Figura
1), relaciona, el RCF, la velocidad del rotor (rpm) y el radio promedio de rotación (r, cm),
de manera que si se conocen, el radio y la velocidad, es posible estimar a partir de estos,
el campo centrífugo relativo (RCF) aplicado. En la figura 1 se indica que un RCF cercano a
600 g se puede conseguir con un rotor de 6 cm de radio y una velocidad de 3 000 rpm. El
valor de RCF se puede confirmar, si se sustituyen los datos de radio y velocidad en la
ecuación 4.
En función de la magnitud del RCF, las centrífugas se clasifican en: centrífugas clínicas
(500 – 4 000 g), super centrífugas (4 000 - 20 000 g) y ultra centrífugas (30 000 - 500
000 g).
Figura 1. Nomograma que relaciona el radio, el campo centrífugo relativo, RCF y la velocidad del
rotor. (Williams B. y K. Wilson, 1976. Principles y Techniques of Practical Biochemistry. London: E.
Arnold).
En la figura 2 se presenta un esquema para separar por centrifugación, los diferentes
componentes de un homogeneizado de tejido. Así, para obtener células enteras se deberá
aplicar al homogeneizado un RCF de 600 g y para aislar mitocondrias, lisosomas y
peroxisomas, el RCF deberá ser aproximadamente de 20 000 g. En una centrífuga, las
partículas a separar están normalmente en un medio líquido, contenido en un tubo o
botella, que luego se coloca en un recipiente llamado “camisa”, el que se coloca en el
“rotor”.

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Figura 2. Esquema de centrifugación diferencial para un homogenado.
(http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3).
Suero y Plasma
El suero sanguíneo es el líquido amarillento que se obtiene
después de centrifugar a 600 g, la sangre sin anticoagulante
(tubo con tapón rojo).
El suero sanguíneo se diferencia del plasma en que no
contiene Fibrinógeno, proteína implicada en la formación del
coágulo. En el suero, el Fibrinógeno se transforma en fibrina,
principal constituyente del coágulo. La formación del coágulo
está inhibida en sangre capilar o arterial, dado que éstas
contienen anticoagulantes naturales. El suero o plasma
contienen diversos componentes nitrogenados como: proteínas,
enzimas, anticuerpos, hormonas, factores de coagulación,
ácidos nucleicos, así como moléculas nitrogenadas de bajo peso
molecular como urea, aminoácidos, glutatión entre otros, los
que tienen la característica de que no son removidos al
adicionar un agente precipitante.
Para obtener plasma, la centrifugación de la sangre se realiza en presencia de algún
anticoagulante como Etilendiaminotetracético (EDTA), citrato de sodio, oxalato de sodio o
heparina, esto en función del análisis a realizar. Los tubos con tapón morado o “lavanda”,
contienen EDTA (Benjamin, 1981).
El líquido amarillento obtenido después de centrifugar a 600 g, representa el plasma
sanguíneo. Debajo del plasma quedan sedimentados los glóbulos blancos, las plaquetas y
los glóbulos rojos.
Figura 3. Fracciones
resultantes de centrifugar
sangre a 600g.
(www.ulcerayozono.com.ar)
.

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Las precauciones y los procedimientos de conservación de suero/plasma varían en cada
caso, según la naturaleza de la muestra y los parámetros que vayan a determinarse en
ella.
Aislamiento de fracciones subcelulares mediante gradientes
La separación de organelos del citosol para el posterior aislamiento de una biomolécula,
constituye una etapa muy importante en los estudios bioquímicos. Los métodos a seguir
para la separación dependen del tipo de tejido y del tipo de ubicación del organelo o
molécula en la célula.
Un primer paso a realizar es la separación, ésta requiere de la homogenización del tejido
en un medio isosmótico y amortiguado. Este procedimiento deja a las células y organelos
(núcleos, mitocondrias, lisosomas) casi intactos, de modo que aprovechando que estos
tienen diferente tamaño y gravedad específica, la separación entre ellos se puede lograr
mediante una centrifugación diferencial o centrifugación isopícnica utilizando soluciones de
sacarosa, con lo que las partículas sedimentan con diferentes velocidades, ubicándose en
diferentes zonas del gradiente produciéndose un fraccionamiento del contenido
citoplásmico.
Mediante una cuidadosa separación del material de cada región del gradiente y su
observación al microscopio es posible definir la posición de cada organelo y obtenerlos
purificados para posteriores estudios bioquímicos, como ubicación de proteínas, enzimas y
rutas metabólicas.
Sacarosa y Cloruro de Cesio (CsCl) son algunos de los materiales utilizados para separar
organelos mediante gradiente (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf).
D. Material y Reactivos
 Material y equipo
Centrífuga clínica con camisas para tubos de 13 x 100 mm, Balanza de dos platillos, Tubos
Eppendorf de 1 y 2 ml con gradilla, Piceta, Pipeta Pasteur larga (22 cm) y cortas, bulbo
para pipeta Pasteur, Tubos Vacutainer de 5 ml con tapón rojo y con tapón morado
(lavanda), Tubo de Wintrobe de 0-100 mm, jeringas de 5 ml o agujas estériles.
 Reactivos
Muestra de sangre

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E. Metodología
E.1. Procedimiento para usar la Centrífuga Clínica
3. Permitir que la centrífuga frene por sí sola. ¡No frenar manualmente!, pues se daña
el equipo y el material puede resuspenderse nuevamente. No abrir la centrífuga
cuando esté en movimiento.
4. Al final, dejar limpias las camisas, colocarlas en su lugar, desconectar el aparato,
acomodar el cable de forma segura y colocar la centrífuga en su lugar.
E. 2 Obtención de plasma sanguíneo (Coles, 1989, Bateman, 1970).
1. Extraer con jeringa, 3 cm3
de sangre y depositarla cuidadosamente en un tubo
Vacutainer CON anticoagulante (Tubo con tapón lavanda). Mezclar muy bien.
2. Medir el radio de rotación de la centrífuga y calcular la velocidad que se debe aplicar
para obtener un RCF de 600 g y centrifugar el tubo Vacutainer por 20 minutos.
3. Después de obtenido el plasma en el tubo Vacutainer, con ayuda de una pipeta
Pasteur, transferirlo (fase superior amarillenta) a un tubo de ensayo pequeño limpio y
seco.
4. Refrigerar el plasma a 4°C o guardar en congelación.
1. Los tubos conteniendo el material a
centrifugar, se colocan en las camisas
apropiadas y utilizando una balanza de dos
platillos, se equilibran en peso. Esta
operación deberá realizarse en pares. De no
seguir esta indicación, se estará causando
daño a la centrífuga. En la igualación de
peso, puede adicionarse agua entre la camisa
y el tubo o si es posible, puede adicionarse
más del material a centrifugar al tubo que lo
necesite.
2. Las camisas con los tubos, equilibradas en
peso, se colocan en el rotor o cabezal, una
frente a otra dentro de la centrífuga y se inicia
la operación de la centrífuga. Esto deberá
hacerse gradualmente, hasta alcanzar la
velocidad requerida. Sí existen problemas de
vibración, repetir el balanceo de las camisas
con los recipientes conteniendo las muestras.
Figura 4. Centrífuga y rotor (color
azul) con camisas (color negro).

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E.3 Obtención de suero sanguíneo
E.4 Determinación de hematocrito (macrométodo)
1. Llenar un tubo de Wintrobe con sangre total con anticoagulante, aplicando la
sangre desde el fondo hasta la marca superior del tubo, teniendo cuidado de no formar
espuma. Para esta aplicación utilizar una pipeta Pasteur larga.
2. Centrifugar el tubo de Wintrobe por 15 minutos a 600 g.
3. Medir el nivel de la columna del paquete celular, directamente en el tubo graduado.
Determinar el % de hematocrito. Comparar el resultado con el valor de referencia para
el tipo de sangre empleada.
F. Cálculos y Resultados
1. Determinar el % de Hematocrito. Analizar la congruencia del resultado, mediante la
comparación con el valor de referencia. [bovino: 24-46% (Mundo pecuario), hombre:
40.7-50.3 %].
2. Con base en el % de Hematocrito, calcular el porciento de plasma en la muestra.
G. Autoevaluación
1. Dibujar y describir los componentes principales de la centrífuga.
2. ¿Cuáles son los principales métodos y técnicas bioquímicos empleados para estudiar a
la célula y al metabolismo celular?.
Figura 5. Tubos para obtención de plasma (tubo
tapón morado) y suero (tubo tapón rojo).
http://www.sanmarcovet.it/pagina.asp?m1=211&m2=1025
1. El suero se obtiene aplicando la misma
técnica que para obtener plasma, solo
que la sangre se deposita en un tubo
Vacutainer SIN anticoagulante, (tubo
con tapón rojo).
2. La sangre se deja coagular a
temperatura ambiente por 20 minutos y
se centrifuga por 20-30 minutos a 600 g.
Posteriormente se separa el suero (fase
superior amarillenta), se transfiere a un
tubo de ensayo seco y limpio y se
refrigera a 4°C o se congela.

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3. Respecto a los anticoagulantes: a) su mecanismo general de acción y c) el mecanismo
de acción del EDTA. (http://biometriahematica.blogspot.mx/ y Benjamin, 1991)
4. ¿Qué proteína diferencia al suero del plasma?.
5. Explicar el efecto de la aplicación de un RCF de 600 g sobre a) sangre y sobre b) un
homogenado de tejido.
6. Explicar el resultado de aplicar un RCF de 5 000 g a un homogenado.
7. Describir dos casos en los que se presenta alteración en la concentración del
hematocrito y su significado clínico.
8. Obtener el factor de 1.11 x 10-5
de la ecuación 4.
9. Describir los tipos de rotores y el tipo de rotor que se utilizó en la presente práctica.
(http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf). Página 15.
10. Es posible separar membranas plasmáticas a partir de un homogenado de tejido, si se
aplica un campo centrífugo relativo (RCF) de 20 000 g. Utilizando el nomograma,
indicar dos condiciones de radio y velocidad del rotor con las que puede alcanzarse
este campo centrífugo relativo.
11. A partir de la ecuación correspondiente, calcular el RCF obtenido, si el radio del rotor
es 11 cm y la velocidad es 35 000 rpm.
12. Describir cómo centrifugaría un homogenado de músculo cardíaco para aislar
ribosomas, los que requieren 150 000 g.
13. Si se parte de 5 cm3
de sangre entera de bovino, teóricamente, ¿cuántos cm3
de
plasma se deberán obtener?.
14. De acuerdo a la información sobre anticoagulantes, discutir qué anticoagulante es
más adecuado para análisis bioquímicos.
15. Si el hematocrito es del 35%, ¿qué volumen de plasma se obtendrá, si se parte de 2
ml de sangre?.
16. Explicar si es mejor, el suero o plasma para realizar análisis químicos y bioquímicos.
17. En general, ¿cuál es el método correcto para conservar plasma sanguíneo y sangre
entera, en caso de no utilizarse pronto?.
18. ¿Qué se indica en la referencia #4 (Cap. 5) respecto al tiempo de ayuno recomendado
para la toma de muestra de sangre?. ¿Qué metabolitos aumentan y cuales disminuyen
durante el ayuno prolongado?.
19. Elaborar un glosario con términos relacionados con la presente práctica.
H. Bibliografía
1. Bateman, J. V. 1970. Nutrición Animal. Manual de Métodos Analíticos. México,
D.F.: Herrero, Hnos. Los capítulos 3 y 14 son especialmente útiles para esta práctica,
pues tratan información general del laboratorio. Algunos de los métodos empleados en
Bioquímica, son descritos en el capítulo 3. En el capítulo 14, se tratan algunos
aspectos sobre la obtención y conservación de las muestras de sangre, que son de
interés para la presente práctica.
2. Benjamin, M. M. 1991. Manual de Patología Clínica en veterinaria. Caps 1,9.
México: Editorial Limusa. El capítulo 1 contiene amplia información sobre los

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anticoagulantes más comunes, mientras que en el capítulo 9 se desarrolla el tema del
hematocrito.
3. Coles, H. E. 1989. Diagnóstico y Patología en Veterinaria. 4ª Ed. México, D.F.:
Ed. Nueva Editorial Interamericana. El capítulo 1, expone el material básico para
integrar un laboratorio clínico, así como las observaciones que deben seguirse para
obtener una muestra biológica procedente de un animal enfermo y como enviarla al
laboratorio. El capítulo 6 incluye temas como: recolección y manejo correcto de
muestras de sangre, de suero y plasma, filtración y centrifugación, uso de pipetas,
colorimetría y control de calidad, entre otros.
4. García, S. Y. 2009. Curso de laboratorio. Recuperado el 17 de enero de 2016 de:
http://www.mailxmail.com/curso-laboratorio-obtencion-muestras/muestras-sangre-
extraccion-procedimientos-previos.
5. Kaneko, J. 1989. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. Ed. 4th
. Academic Press.
6. Lehninger, A. L.; D. L. Nelson y M. M. Cox. 1995. The Cells. Principles of
Biochemistry. Cap. 2. 2nd
Ed. New York. N. Y.: Worth Publishers Inc.
7. Mathews, C. W., van Holde, K. E. y Ahern, K. G. 2002. Introducción a las proteínas:
nivel primario de la estructura proteica. Herramientas bioquímicas.
Bioquímica. Cap. 5. 3ª ed. Madrid, España: Pearson Educación, S. A.
8. Montero, L. de G. (s/f). Métodos de centrifugación. Recuperado de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf. Consultado el 11 de
enero de 2016.
9. Murray, R. K., P. A. Mayes, D. K. Granner y V. W. Rodwell. 2001. Bioquímica de
Harper. 15ª ed. México, D.F.: Editorial El Manual Moderno.