-ANALISIS CLINICO -UIGV -Karloz 30-33 -CLASES: https://www.youtube.com/watch?v=3P-1xBJ-t2Q&list=PLpiTFUdDzYBcRk1S_ECQG2FGeOh-5Ax7y

1. LA REACIÓN
ANTÍGENO - ANTICUERPO
Mg. Benites Azabache Juan Carlos

2. Concepto de reacción Ag - Ac
• Cuando un Ac entra en
contacto con un Ag contra
el que está dirigido, ambos
se unen formándose un
complejo Ag-Ac.
• La unión Ag-Ac es
reversible.
• La permanencia de la unión
depende de:
– Grado de adaptación entre
ambas moléculas.
– Fuerza y estabilidad de los
enlaces que las unen.

3. Características de la Interacción
Antígeno - Anticuerpo
 Específica
 Reversible
 Dependiente de pH
 Sensible a la Temperatura
 Sensible a la fuerza iónica

4. Enlaces que intervienen en la unión Ac-Ag
• No son covalentes. Son cuatro tipos:
1. Electrostáticos: Entre grupos iónicos (NH3+ y -COO-) de Prots.
distintas.
2. Puentes de hidrógeno entre grupos polares hidrofílicos (-OH, -
NH2, -COOH).
3. Hidrofóbicos: Gr. No polares hidrófobos en medio acuoso
(cadenas laterales de algunos AA.)
4. De van der Waals: Fuerzas intermoleculares débiles de origen
eléctrico que se ejercen a distancia entre moléculas.
• Las fuerzas de unión de cada uno de ellos son menores que en los
covalentes, pero en conjunto consiguen una considerable energía
de unión.

5. COMPLEMENTARIEDAD DE EPÍTOPE Y PARATOPE
• EPÍTOPE Y PARATOPE han
de tener estructuras
complementarias que
encajan entre sí.
• Se forman varios enlaces no
coovalentes
simultáneamente.
• La distancia entre Ag y Ac es
muy pequeña en el punto
de unión, lo que incrementa
la fuerza de esa unión.

6. AFINIDAD DEL ANTICUERPO
• Es la fuerza de unión entre el Ac con su Ag
• Determina la atracción entre ellos.
• Esa fuerza es la suma de las fuerzas de los enlaces que
intervienen en la unión.

7. AVIDEZ DEL ANTICUERPO
• Es una medida de la fuerza de unión
y estabilidad del complejo:
Ag multivalente – Ac multivalente.
• Ac multivalentes: Tienen más de un
punto de unión para Antígenos.
• Ag multivalentes: Tienen varios
determinantes antigénicos (más de
un punto de unión para los Ac).
• La fuerza de unión es mayor que la
suma de las afinidades de cada uno
de los puntos de unión

8. ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO
• Si un anticuerpo reacciona solo
con un Ag: Es muy específico.
• Si un Ac reacciona con varios
Ag: Tiene una especificidad
baja. Se habla de REACTIVIDAD
CRUZADA.
• Esto ocurre porque varios
antígenos tienen uno o más
determinantes antigénicos
iguales o similares, capaces por
tanto de unirse al mismo Ac.

9. REACCIONES ANTIGENO ANTICUERPO
APLICACIÓN AL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

10. Los anticuerpos como sondas
para buscar antígenos de interés
 Especificidad
 Sensibilidad
 Estabilidad
 Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, etc.
 Tiempo de ejecución razonable: minutos a ~ hrs
 Costo conveniente
 Infraestructura mínima
Ventajas

11. Técnicas Inmunoanalíticas
- Reacción de precipitación
En medio líquido
 Floculación
 Nefelometría
 Precipitación de complejos Inmunes
En gel  Inmunodifusión doble
 Inmunodifusión radial
 Inmunoelectroforesis
 Rocket electroforesis
 Contrainmunoelectroforesis
 Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel
- Reacción de aglutinación
 Aglutinación pasiva
 Aglutinación directa
- Fijación y actividad hemolítica del complemento
- Reacciones en fase sólida
o ELISA
o Western blot

12. REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACION
CARACTERISTICAS:
Ag solubles
Ac de clase Ig G
Reacción poco sensible
Reacción muy específica
Intervienen Ac policlonales frente a Ag
polivalentes

13. • Modalidades:
• Inmunoprecipitación simple en tubo
• Inmunodifusión o Inmunoprecipitación en
medio sólido:
Inmunodifusión simple: en tubo (Oudin)
En placa o Radial (Mancini)
Inmunodifusión doble o radial (Ouchterlony)
Inmunoelectroforesis (Grabar y Willians)
Contrainmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis en cohete (Rocket y Laurel)
Inmunoelectroforesis bidimensional.

14. Reacciones de Precipitación y
Floculación en solución
Equivalencia
Tiroglobulina agregada (mg)
Precipitadodeproteínas(mg)
Reacciones de sueros humanos de pacientes con
Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.

15. Inmunodifusión Doble
(o de Ouchterloni)
Ej: Mezcla de antígenos y suero
polivalente
AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humano
HSA: Albúmina humana purificada
HIg: Inmunoglobulina humana purificada
Suero humano
HSA
Suero humano
HIg

16. Ensayo Immunoturbidimétrico
 Suero + Ag complejos insolubles
 Aumenta turbidez de la solución
y puede ser medida ópticamente
 Turbidez proporcional a la cantidad
de proteínas en la muestra
Sensibilidad de método se puede
incrementar con los anticuerpos
Unidos a látex: mayores agregados

17. Inmunodifusión Radial
Anticuerpo incorporado al gel
El tamaño de los halos es
proporcional a la
concentración del
antígeno
Ag

18. • REACCIONES DE AGLUTINACION
• Características:
• Ag particulados, generalmente poliantigénicos
• Ac de clase Ig M e Ig G
• Reacción con Ag superficiales.
• Reacción bastante sensible
• Reacción relativamente específica
• Intervienen Ac policlonales frente a Ag
polivalentes.

19. • Modalidades:
Aglutinación directa:
Cualatitativa/cuantitativa
En tubo/en porta
Aglutinación pasiva:
Prueba de Coombs directa e indirecta
Hemaglutinación pasiva
Prueba de Látex
Pruebas de coaglutinación

20. Reacciones de Aglutinación
Aglutinación Directa: Las
partículas o células tienen un
antígeno intrínseco.
Aglutinación Pasiva:
partículas o células a las
cuales se le agrega el
antígeno
Se considera aglutinación cuando el antígeno es
particulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano

21. Reacciones mediadas
por Complemento
Lisis celular

22. REACCIONES DE FIJACION DEL COMPLEMENTO
Reacción positiva (No hemolisis)

23. Reacción Negativa (Hemolisis)

24. Reacciones en fase sólida
 ELISA
 Western blots
 Inmunofluorescencia
Cromatografía de Afinidad

25. ELISA
(Enzime linked
immunosorbent assay )
Detección de anticuerpos Detección de Antígeno

26. Determinación de antígenos
por ELISA
Competencia Sándwich
[ Ag ]
Densidadóptica
[ Ag ]
Densidadóptica
Caso de Haptenos Caso de Proteínas

27. Método indirecto
• También conocido como método Sándwich
(Antígeno-anticuerpos-anticuerpo), se basa en la
fijación de un antígeno a la fase sólida, el cual
atrapa los anticuerpos homólogos en la
muestras que posteriormente son identificados
con un anticuerpo específico marcado con una
enzima. En estos casos la cantidad de antígeno
es directamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado.

28. Directo
• Detecta al antígeno y se basa habitualmente en la
captura de este por anticuerpos específicos unidos a
una fase sólida
• El antígeno presente en la muestra se combina con el
anticuerpo fijado.
• El antígeno se detecta con otro anticuerpo específico
conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato
para la enzima y se mide la intensidad de color.

29. Método competitivo
• Se basa en la competencia que se establece
entre un antígeno marcado enzimáticamente
y el mismo antígeno sin marcar (muestra
objetivo) al ser colocados frente a una
cantidad limitada del anticuerpo homólogo
fijado a la fase sólida. En estos casos la
cantidad de antígeno es indirectamente
proporcional a la cantidad de producto
enzimático formado.

30. Western blot
Anticuerpo específico
Anti-anticuerpo-Enzima
Sustrato
Precipitado producto enzimático
Quimioluminiscencia

31. Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo anti-Acrosina
Anticuerpo anti-Ag de
embrión de ratón
Se puede hacer con células vivas o fijadas,
con o sin permeabilizar.

32. Cromatografía de Afinidad
Anticuerpo
Anticuerpo no unido
Buffer de elusión
Elución de Anticuerpo
Ej: Purificación de un anticuerpo
uniendo el antígeno a una resina (sp).
Sin embrago, también se puede hacer
lo contrario.

33. Quimioluminiscencia
• Es el fenómeno que ocurre en las
luciérnagas:
• una reacción química con un muy alto
rendimiento energético produce una
molécula potencialmente fluorescente.
• (No hay excitación luminosa como en la
fluorescencia)
• Usualmente son reacciones redox
catalizadas por enzimas que involucran O2
o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La
energía se libera como luz visible.

34. Quimioluminiscencia
Oxidante
(H2O2,, perborato Na)
Luminol
PO
N2
Intermediario
electrónicamente
excitado
Luz,
425
nm
aminoftalato