1. MICROBIOLOGIA APLICADA
Manual de Laboratorio
PRACTICA Núm. 4
TINCION DIFERENCIAL DE GRAM
I. OBJETIVO
Distinguir las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
II. INTRODUCCION
La técnica de coloración de Gram es de gran utilidad en Bacteriología, ya que
permite diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. Casi la
mitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativas.
El método fue descubierto por Christian Gram (Danés), en 1884, quien observó
que en cortes histológicos que contenían bacterias coloreadas con violeta de
genciana y tratadas con solución acuosa de yodo, este colorante podría ser
removido del corte histológico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias.
Posteriormente descubrió que no todas las bacterias retenían al violeta de
genciana sino que algunas eran decoloradas por acción del alcohol. A las primeras
las llamó Gram positivas y a las segundas Gram negativas. Estas que quedan
incoloras son teñidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste como
la safranina, para hacer posible su observación.
Existen muchas modificaciones de esta coloración, pero fundamentalmente es lo
mismo.
III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS
− Gradilla.
− Portaobjetos.
− Asa bacteriológica.
− Mechero Bunsen.
− Cerillos ó encendedor.
− Lápiz graso.
− Papel absorbente.
− Hisopos.
− Microscopio.
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− Aceite de inmersión.
− Cristal violeta.
− Lugol.
− Alcohol al 95%.
− Safranina.
− Cultivos bacterianos: A, B y C.
IV. TECNICA
1. Preparar 3 extensiones (frotis) en la forma ya indicada.
2. Cubrir la extensión con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.
3. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación y sacudir
para eliminar el exceso de agua.
4. Cubrir la extensión con solución de lugol y dejar actuar por un minuto.
5. Lavar con agua corriente.
6. Decolorar con alcohol al 95 ó 96%, aproximadamente 10 segundos ó hasta
observar el alcohol transparente.
7. Lavar con agua corriente.
8. Cubrir la extensión con Safranina y dejar actuar por 1 minuto.
9. Lavar con agua corriente.
10. Secar la preparación al aire o colocándola entre papel absorbente.
11. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al
microscopio con objetivo de inmersión.
INTERPRETACION:
• Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se teñirán en azul ó
morado.
• Las Gram negativas se tiñen en rojo ó rosa.
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12. Dibujar lo observado:
Cultivo A. Cultivo B.
Cultivo C.
V. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento de la Tinción Diferencial de Gram?
2. ¿Cuál es la función que desempeña el Lugol en esta coloración?
3. Escribir el nombre científico (Género y especie), de 5 bacterias Gram positivas y
5 Gram negativas.
4. Consultar la técnica de otra tinción diferencial.
5. Explicar: ¿Por qué algunos microorganismos Gram positivos en un cultivo joven
pueden volverse Gram negativos cuando éste envejece?
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