Guía para preparación de exposición

2. VALORACIÓN DE LA
INMUNIDAD CELULAR IN
VITRO
Por: Sofía Jaramillo Q.

3. OBJETIVOS
GENERALES:
ESPECÍFICOS:
• Identificar los procedimientos de
laboratorio que permiten la
valoración de la inmunidad
celular in vitro.
• Identificar los procedimientos
de laboratorio que se emplean
para evaluar la inmunidad
celular.
• Esquematizar las fases del
estudio de la inmunidad celular
en los procedimientos de
laboratorio.
• Definir los criterios clínicos
para la solicitud de éstos
análisis.

4. CONOCIMIENTOS PREVIOS
• Desarrollo,
diferenciación,
propiedades
particulares y funciones de los Monocitos,
Neutrófilos, Basófilos, NK, LT y LB.

8. ORIGEN DE LOS ESTUDIOS
SOBRE INMUNIDAD CELULAR
Estudios en otras especies: aves y
mamíferos
Pacientes con inmunodeficiencias
Ac. Monoclonales
Análisis funcionales in vitro

9. SEPARACIÓN
• M. Físicos
• Fycoll-Hypaque
• Adhesión
selectiva
• M s:
vidrio,
plástico
• LB, LT: nylon,
algodón
• M.
Inmunoquímicos
• Poblaciones
• Subpoblaciones
IDENTIFICA
CIÓN
• Cualitativa
• M.
Inmunoquímico
• Células
Formadoras de
Rosetas
• Cuantitativa
• M. Físicos
• S. Magnética
• S. Por afinidad
de columnas
• M.
Inmunoquímico
• -Globulina
Antihumana
• Citometría
de
Flujo con FACS
RECUENTO
• Microscopía
de
fluorescencia
• Citometría de flujo
• IF
• RIA
VALORACIÓN
FUNCIONAL
• Test de Actividad
Fagocítica
• Directa
• Indirecta
• P. De Proliferación
Celular
• Ensayo
de
Proliferación
• Reacción
linfocitaria mixta
• LT-CD4
• Prueba del IFN• ELISPOT
• Citometría
de
Flujo (Citoquinas
internas)
• LT-CD8 y NK
• ADCC

10. MATERIALES
SUSTRATO CELULAR:
• Citología:
• Suspensiones frescas de sangre (plasma) *
• Histología:
• Usual:
• Punción M.O.*
• Transoperatorios
• Biopsias
• Post mortem
• Especial:
• Punciones de extracción de líquido

11. TÉCNICA HISTOLÓGICA

12. PROCEDIMIENTOS
OBTENCIÓN DE LA
MUESTRA
CORTE
PROCESAMIENTO
COLORACIÓN
FIJACIÓN
INCLUSIÓN
ANÁLISIS

13. SEPARACIÓN
AISLAMIENTO POR
CENTRIFUGACIÓN EN
GRADIENTE DE DENSIDAD:
TÉCNICA FICOLL-HYPAQUE
SEPARACIÓN POR
ADHESIÓN SELECTIVA
Los monocitos se adhieren a
superficies de vidrio o plástico y
se separan de los linfocitos
Separación de mononucleares
[M s y Linfocitos (LB, LT)]de
granulocitos (N s, Bas)
Los linfocitos B se fijan a
columnas o jeringas en lana de
nylon o algodón (se obtienen
poblaciones separadas de LB y
LT)

14. TÉCNICA FICOLL-HYPAQUE

15. ADHESIÓN SELECTIVA
LT
M s

16. IDENTIFICACIÓN
Cualitativa
Cuantitativa
M. Físicos
•
•
•
•
M. Inmunoquímico
• Células Formadoras de Rosetas
S. Magnética
S. Por afinidad de columnas
Cargas eléctricas (LB , LT)
Aglutininas
• Maní: Timocitos inmaduros
• Soja: LB
M. Inmunoquímico
• CD
• -Globulina Antihumana
• Citometría de Flujo con FACS

17. CÉLULAS FORMADORAS DE
ROSETA E
• Receptor SRBC o CD2
• CA linfoide

18. MÉTODOS FÍSICOS
MAGNÉTICA
POR AFINIDAD DE
COLUMNAS

19. Ag para LT
Producción de Ac. a los globulina+
fluorocromo
LT
• Timocitos, LT sp.,
LT cultivo cont., LT
leucémicos
cabras o conejos
• Hibridoma murino
• Demostración
de
especificidad
Identificación de los
marcadores de LT por el
antisuero resultante
• IF Directa
• Microscopio de
fluorescencia
• Citómetro
de
flujo*
• Tinción vital con
azul trípano
• Análisis
de
liberación de Cr51
(RIA)

20. IDENTIFICACIÓN LT:
MARCADORES ESPECÍFICOS
TIPO DE CÉLULA
DETECTADO
CD
Timocitos de la corteza
Células de Langerhans
CD1
Células formadoras de rosetas
LT
NK
CD2
LT maduros
Receptor para Ag. En LT
CD3
LT colaboradores/inductores
Monocitos
CD4
LT maduros
CD6
Timocitos
NK
CD7
LT supresores/ctx.
NK
CD8
Relación
LT-CD4/LT-CD8:
2/1

21. RECUENTO
Microscopía de
fluorescencia
Citometría de
flujo
RIA
IF

22. CITOMETRÍA DE FLUJO
PROCEDIMIENTO:
RESULTADOS:

25. APLICACIONES DE LA
CITOMETRÍA DE FLUJO
Tipificación del
Fenotipo
Leucocitario
TIPIFICACIÓN
DEL FENOTIPO
TUMORAL
• Inmunodeficiencias
• Pronóstico
• Seguimiento
de
inmuno
y
quimioterapia
• Seguimiento de la
reconstitución
inmunitaria
• Clasificación
de
leucemias
y
linfomas
• Determinación de la
clonalidad
• Diferenciación entre
neoplasias
de
células hemato y no
hematopoyéticas
• Pronóstico
ANÁLISIS DEL
ADN
OTRAS
APLICACIONES
• Aneuploidía
• Cinética del ciclo
celular
• Reticulocitos
• Detección de Ig.
Relacionadas con
Px.
• Pruebas cruzadas en
transplantes
• Citogenética

26. VALORACIÓN FUNCIONAL
Test de Actividad
Fagocítica
Migración
Ingestión
Digestión
•Degranulación:
Fagocitosis
frustrada
•Muerte
Intracelular: NBT,
Quimioluminiscen
cia, 502ª de S.
aureus
Prueba de
Proliferación
Celular
Ensayo de
Prolifera
ción
•Leucocrito+Mitó
geno (específico)
•Medir el estado
global
de
la
respuesta celular
Reacción
linfocitaria
mixta
•CPA (MHC-II)
•Inmunidad
transfucional
•Dx. Exposición
previa
LT-CD4
Prueba del
IFN-
LT-CD8 y
NK
ADCC
LT-CD8:
Determinación
de lisis celular
(CMHI)←Cr51
Células+Ac
ELISPOT
Citometría de
Flujo
(Citoquinas
internas←Ac.)
NK: Líneas
de
células
tumorales
M s, N s, E
s, NK

27. ACTIVIDAD FAGOCÍTICA

28. PROLIFERACIÓN CELULAR
ENSAYO DE
PROLIFERACIÓN
REACCIÓN LINFOCITARIA
MIXTA

29. LT-CD8: CITOTOXICIDAD

30. NK Y CÉLULAS TUMORALES

31. ADCC

32. IMPORTANCIA
FISIOLÓGICA
Inmunidad
antiinfecciosa
PATOLÓGICA
Trastornos de
inmunodeficiencia
Inmunidad
transfusional
Inmunidad tumoral
Enfermedades
autoinmunitarias

33. AVERIGUAR
•
•
•
•
Nombres de mitógenos específicos.
Importancia del cultivo mixto linfocitario en la medicina transfusional.
Líneas de células tumorales empleadas en los ensayos de laboratorio para la
valoración de la actividad de los NK.
Citoquinas implicadas en la :
– Migración
– Adherencia
– Lisis mediada por M s.
•
•
•
•
Indique la importancia de la citometría de flujo en la estadificación del VIH.
Consultar las causas de variación (en ↓ y en ↑) de la relación LT-CD4/LT-CD8.
Señale las diferencias entre Th1 y Th2.
Enumere los Ag. Relacionados con células leucémicas.

34. BIBLIOGRAFÍA
•
•
•
•
•
•
•
•
Balcells, A.; Soriano, M. La Clínica y el Laboratorio. 9na. Edición. Editorial
Marín. Barcelona – España. 1973.
Henry, B.; et all. Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Editorial Marbán Libros.
Madrid – España. 2010.
Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunología de Kuby. 6ta. Edición. Editorial
Mc Graw-Hill. México D.F.-México. 2007.
Prieto, J. Yuste, J. La Clínica y El Laboratorio Balcells. 21era. Edición. Editorial
Elsevier Masson. Barcelona – España. 2010.
Regueiro J., López C., González S., Martínez E. Inmunología. 4ta. Edición
Revisada. Ed. Médica Panamericana. Madrid - España. 2012.
Rojas, W., Anaya J., Aristizábal B., Cano L., Gómez L., Lopera D. Inmunología de
Rojas. 15ta. Edición. Corporación para las Investigaciones Biológicas. Medellín –
Colombia. 2010.
Stites, D.; Stobo, J.; Wells, J. Inmunología Básica y Clínica. 6ta. Edición. Editorial
El Manual Moderno. México D.F. – México. 1988.
Stites, D.; Terr, A. Inmunología Básica y Clínica. 7ma. Edición. Editorial El
Manual Moderno. México D.F. – México. 1993.