Jornadas de arbovirosis: dengue, chikungunya y Zika. Preparación y respuesta de los países del Cono Sur. Buenos Aires, Argentina, 4-5 noviembre 2015.

1. VIGILANCIA DEL VIRUS
CHIKUNGUNYA POR
LABORATORIO EN ARGENTINA
Bioq. Victoria Luppo
Laboratorio de Arbovirus
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH)
“Dr. J.I.Maiztegui”- ANLIS, Pergamino-Argentina

2.  Virus del género Alphavirus y Flia Togaviridae
 Deriva de Makonde: “aquel que se encorva”
 Son esféricos, con una nucleocápside dentro
de una envoltura lipoproteica.
 Son virus con genoma de RNA de
polaridad positiva de aprox. 11.5 KB
 Genes proteínas no estructurales: replicación del
virus; genes de proteínas estructurales: implicadas
en el reconocimiento con el sistema inmune
(epítopes específicos)
CHIKUNGUNYA
Proteínas no estructurales Proteínas estructurales
Está Relacionado Genéticamente Y
Serológicamente a O’nyong-nyong, Igbo
Ora Y En Menor Medida Mayaro Y Ross
River
• 1 Serotipo
•3 Genotipos Principales:
•Africa Occidental (selvatico)
•Africa Central/Este/Sur (ECSA)
•Asiatico-Americano

3. Selección, recolección y envío de muestras

4. VIREMIA Y CINETICA DE
ANTICUERPOS EN INFECCIONES POR
CHIKV
DIAS DE EVOLUCIÓN

5. Técnicas de laboratorio para
CHIKAislamiento viral e identificación
por IF o RT-PCR
Detección de
genoma viral
(RT-PCR
convencional y en
Tiempo Real )
Detección de anticuerpos contra
proteínas virales: Elisa IgM/IgG,
Neutralización por reducción del
número de placas.

6. Algoritmo para detección de CHIKV, DENV y
requerimientos de Bioseguridad
Muestra de Caso sospechoso de CHIKV y
DENV
< 8 días de evolución
RT- PCR DENV y CHIKV
NegativoPositivo
Negativo Positivo
IgM CHIKV
Negativo
Positivo
Estudiar por
técnica de
neutralización
para DEN y otros
Flavivirus
(BSL2, virus
quiméricos para
SLEV y WN, cepa
vacunal YFV)Aislamiento Viral
(BSL3)
Serología en
casos
RT-PCR (-) CHIK
en BSL2
Estudiar PAR SEROLÓGICO
por Neutralización r técnica
de para CHIK y otros
Alphavirus (BSL3)
Inactivación
1er paso
extracción
del RNA
(BSL2)
ELISA IgM DENV
(desde 4 dpi)
Secuenciación –
Filogenia
Solicita
Segunda
muestra
para repetir
serología

7. Algoritmo para detección de CHIKV, DENV y
requerimientos de Bioseguridad
Caso sospechos de DENV y CHIKV
≥ 8 días de evolución
ELISA IgM DENV y
CHIK V
Negativo DENV y
CHIKV
Positivo DENVPositivo
CHIKV
Serología
en BSL2
Estudiar
PAR SEROLÓGICO por
técnica de
neutralización para
CHIK y otros Alphavirus
( BSL3)
Estudiar
PAR SEROLÓGICO por
técnica de neutralización
para DENV y otros
Flavivirus
(BSL2, virus quiméricos
para SLEV y WN, cepa
vacunal YFV)
•Búsqueda de otros
Arbovirus
Se descarta caso
de DENV* o
CHIKV
*Estudio de segunda muestra para descartar posible
infección secundaria de DENV sin IgM (Clínica y
Epidemiología)

8. TÉCNICAS DIRECTAS

9. AISLAMIENTO VIRAL
 Gold Stándard de los métodos directos
 Muestra indicada: suero de fase aguda
(< de 8 días de evolución y perfectamente
conservada)
 Inoculación en lineas celulares suceptibles:
BHK-21, HeLa, Vero y C6/36. Efecto
citopático al 3er día.
 Confirmación por técnica de IF , RT-PCR
convencional o en real time del
sobrenadante celular.
 Aislamiento en laboratorio BSL-3 de cepas
obtenidas en el INEVH de casos importados

10. Aislamiento de cepas de CHIKV en el INEVH (BSL 3)
1. Se aislaron en celulas Vero
2. Identificación viral por RT-PCR
Real Time CHIKV
3. Titulación por UFP
4. Secuenciación de un fragmento
de Genoma Viral y filogenia
viral
Muestras de Suero de casos sospechosos
(< 8días de evolución)
 Se han obtenido stocks
virales con titulos ˜ 10 7
ufp /ml:
• cepa Asiatica
(aislamiento viral de
suero de un viajero
detectado en
Argentina)
 Celulas Vero C 76

11. RT-PCR en tiempo real CHIKV
 Inicialmente se usó un protocolo
diseñado por el Dr. Lanciotti 2007
(sensibilidad: 1UFP o 50 copias
genómicas)
 Diseño de sonda y primer en base a la
cepa prototipo S27
 Detecta todos los genotipos West
Africa, ECSA y Asia
 No hay reactividad para otros
Alphavirus (ONN, Ross River, Mayaro,
EEE, WEE, VEE, Semiliki Forest,
Sinbis).

12. RT-PCR en tiempo real CHIKV
• Recientemente se han diseñado 2 sets de primers y sonda más
específicos para el genotipo asiático circulante (Fort Collins- CDC)
(sin publicar aún)
• Se analizaron en el INEVH diluciones seriadas de una de las cepas
aisladas en el INEVH procedente de República Dominicana
Sets de primer y sondas
• Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
• Set 2 (Asiático-América)
3855F
3957c1,2
3996-FAM1,2
• Set 3 (Asiático-América)
856F
962c
908-FAM
Sets de primer y sondas
• Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
• Set 2 (Asiático-América)
3855F
3957c1,2
3996-FAM1,2
• Set 3 (Asiático-América)
856F
962c
908-FAM
Los sets 2 y 3 tienen mayor sensibilidad
que el set 1, por lo cual se recomienda
para el análisis de las cepas que circulan
actualmente en América
Los sets 2 y 3 tienen mayor sensibilidad
que el set 1, por lo cual se recomienda
para el análisis de las cepas que circulan
actualmente en América
nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural

13. RT-PCR convencional genérica para Alphavirus
 Oligonucleótidos degenerados en la región nsp4 (195pb)
 Detección de EEE, WEE, VEE, CHIK, Ross River, Sinbis, Semiliki Forest
 Para identificar el Alphavirus se requiere la secuenciación genómica
nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 C E2 E1
AAAAAAA
No estructural estructural
E3

14. Identificación del
Genotipo Asiático
en viajeros
procedentes del
Caribe
Identificación del
Genotipo Asiático
en viajeros
procedentes del
Caribe
Caracterización Filogenética de cepas
circulantes
CHIKV detectado en Argentina- INEVH
2014
Congreso Argentino de Virología
CAV,2015
Análisis bayesiano, 1200 nt en la
región E ; 155 pb región nsp4.
Árboles de topología similar

15. TÉCNICAS SEROLÓGICAS

16.  Desde el 2011 el INEVH cuenta
con la técnica de Elisa IgM de
captura puesta a punto y
evaluada externamente a través
de proficiencia del CDC
 Permite detectar infección
actual o reciente
 Presenta cruce serológico con
otros alfavirus del mismo grupo
ej: virus Mayaro, Ross River,
Onyong nyong)
 Metodología in house que
utiliza reactivo producido en
INEVH
ELISA de captura IgM CHIK (P/N)
CHIK RR ONN VEE MAY EEE
12.3 1.5 15.3 0.89 1.9 1.2
10.6 1.2 13.9 1.1 1.9 1.3
14.5 1.7 17.3 1.1 3.1 0.89
20.4 0.92 20.7 1.5 7.1 1.8
26.6 4.9 27.4 2.2 1.7 1.5
21.2 1.5 24.7 2.2 1.2 1.6
15.3 1.5 8 1.6 1.9 2.2
31.3 1.5 24.6 1.7 2.9 1.8
22 1.6 15.9 1.8 1.4 1.4
18.8 0.59 13.1 1.2 1.5 1.1
34.3 3.7 22.6 1.6 2.8 9.1
Fuente: CDC

17. 1. Anti IgM humano (4°C toda la noche)
2. Agregar suero de paciente en la dilución adecuada
(37°C , 1 Hora)
3. Agregar Antígeno (chik y normal para la misma muestra)
( 4°C toda la noche)
4. Agregar el Ac monoclonal conjugado con peroxidasa
rábano (37°, 1 Hora)
Fuente: CDC
5. Adición del Sustrato TMB. Dejar 30 min a 37°C y
solución de Stop. Leer a 450 nm

18. Linea Celular
C6 / 36
Incubación
x días, 34ºC
Monitoreo
por ECP y/o IFI
100 % Infección
Descongelamiento
Sonicado y centrifgado
Inactivación por
irradiación gamma
Inoculación viral
ANTIGENO p/ ELISA IgM
Congelamiento -70ºC
VeroC76 /BHK-21

19.  Técnica serológica de referencia
para confirmar el diagnóstico
 Aumento en 4 veces el título
entre muestra
aguda/convalesciente.
 Estudiar especificidad con panel
de Alphavirus
 Se tituló stock viral de MAY para
incorporar al panel

20. INCORPORACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE CHIKV EN LA RED NACIONAL DE
LABORATORIOS PARA DIAGNOSTICO DE DENGUE Y OTROS ARBOVIRUS

21. ¡MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCIÓN!
Bioq. Victoria Luppo
vluppo@anlis.gov.ar
Dra Alejandra Morales
amorales@anlis.gov.ar
Lic Cintia Fabbri
cfabbri@anlis.gov.ar