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1. Francheska Camilo González
Junio/2013
Laboratorio 6: Biología Molecular
6-I Transformación bacteriana
La transformación genética son mutaciones genéticas que suceden por una alteración causada por
un organismo huésped adquiere un DNA extraño y lo expresa como un gen extraño. Este tipo de
mutación puede observarse cuando se introduce un gen resistente a antibiótico ampicilina en una
cepa bacteriana que no es resistente a tal antibiótico. Entonces, si ocurre susceptibilidad
bacteriana al incorporarse al ADN extraño, estas se convertirán o mutaran en bacterias que son
resistentes a la ampicilina.
Colonias Bacterianas
Son millones de células individuales de un tipo de bacteria (ej: Escherichia coli), luego de crecer
en una placa Petri Luria Broth (LB) agar.

2. Escherichia coli
Figure: E. coli Bacteria
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/ecoli.html, Accessed: 6/26/13
Escherichia coli es la bacteria que más comúnmente habita en el intestino de los humanos. Esta
bacteria se reproduce rápidamente, dividiéndose y formando colonias visibles compuestas con
millones de células durante la noche. E. coli no tiene un núcleo verdadero y los genes
reproductivos están presentes en un único cromosoma, y algunas cepas de esta bacteria contienen
plásmidos y moléculas pequeñas de DNA, las cuales llevan genes especializados para funciones
específicas, como la resistencia a ciertos medicamentos.
Plásmidos
Los plásmidos son piezas circulares de DNA localizadas en el exterior del cromosoma bacteriano
primario. Estos tienen sus propios genes para llevar a cabo funciones especializadas, y en la
ingeniería genética son utilizados para la introducción de genes extraños a una célula bacteriana.
Existen células bacterianas como E. coli que contienen un plásmido “ampr+”, el cual es un gen
que confiere resistencia a antibióticos ampicilina. También existen células bacterianas que
carecen del plásmido ampR, siendo células “ampR-”, siendo sensibles a antibióticos, y muriendo
por la presencia de estos. Esto es importante porque una célula (ampR-) puede mutar por
alteraciones o transformaciones genéticas y convertirse en una célula resistente a la ampicilina
(ampR+), por la adquisición de un plásmido que contiene un gen ampR.

3. Células competentes
Las células bacterianas de E.coli son propensas a incorporar un ADN extraño si ocurre alguna
alteración en la pared celular. Cuando ocurre este suceso, estas células se hacen “competentes”
mediante un proceso que utiliza cloruro de calcio y de choque térmico. La tasa de crecimiento en
las células no es constantes, por tanto aquellas células que experimentan un crecimiento muy
rápido tienden a ser competentes con mayor facilidad que las células en otras entapas de
crecimiento.
Figure: Competent Cells
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/competen.html Accessed: 6/26/13

4. Diseño experimento I
1. Conceptos básicos para un procedimiento estéril

5. Figure: Design of the Experiment I
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/design1.html, Accessed: 6/26/13

6. Ejercicio 1: Procedimiento de transformación de E.coli
Utilizando los pasos ilustrados, se procederá a utilizar plásmidos que contienen ampR, para
transformar células de Escherichia Coli que carecen de este gen. También se procederá a preparar
un segundo grupo bacteriano a partir de células de E. coli, las cuales representaran al grupo
control y demostraran que esta bacteria no crece en un agar que contiene ampicilina, con
excepción de bacterias de E. coli en las cuales hubo una transformación genética. El
procedimiento ilustrado se utilizara para los dos grupos experimentales (E. coli con plásmido
“ampr+” y E. coli “control”), con excepción del paso #2, e donde se agrega plásmidos ampR, el
cual no se realizara en las células “control”.
Figure: Transformation Procedure
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/tranproc.html, Accessed: 6/26/13

8. Figure: Transformation Procedure: Step 1-6
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/hotfr01.html, Accessed: 6/26/13

9. Figure: Place the Stages of Transformation in Order
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/test1.html, Accessed: 6/26/13

10. Análisis de resultados I:
Si en agar no hay existencia de ampicilina, E. coli va a crecer en esta, pero si por el contrario hay
ampicilina en el agar, colonias de E. coli no crecerán en esta, a menos que estas células
bacterianas sean transformadas por la adición de plásmidos con ampR.
Figure: Analysis of Results I
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/analysis1.html, Accessed: 6/26/13

11. Etiquetar los resultados experimentales: evidencia

12. Figure: Label the Results of Your Experiment
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/test2.html, Accessed: 6/26/13

13. Lab Quiz: evidencia

19. Figure: Lab Quiz I
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/quiz1.html, Accessed: 6/26/13

20. 6-2 Electroforesis
Para la década de 1960, se descubrió la existencia enzimas en las bacterias que cortan el DNA de
organismos extraños, protegiendo las células de invasores (ej: virus). Estas son enzimas de
restricción o endonucleasas de restricción, y son capaces de reconocer y cortar secuencias
específicas de DNA. El descubrimiento de estas enzimas fue de utilidad para la ingeniería
genética, pues hizo posible que se pudiera cortar el DNA en fragmentos, para luego analizar y
utilizar estos en otros procedimientos.
¿Cómo funcionan las enzimas de restricción?
Estas enzimas de restricción, al igual que el resto de las enzimas son específicas, por tanto
tenderán a cortar fragmentos precisos en la secuencia de DNA, y la secuencia de reconocimiento
en una cadena de DNA lee en una dirección opuesta en la hebra complementaria.
Figure: How Do Restriction Enzymes Work?
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/enzwork.html, Accessed: 6/26/13
Mediante las ilustraciones se pudo observar que ocurrieron tres distintas secuencias de
reconocimiento, pero en las primeras dos se produjeron extremos pegajosos o cohesivos y en la
última ilustración se produjeron “extremos romos”.

21. Cortar DNA utilizando enzimas de restricción
El DNA debe mezclarse con una o más enzimas de restricción en un pequeño tubo de plástico
para centrifugar. En el ejemplo, el volumen total de la mezcla es de aproximadamente 20 µl
(0.02ml). La mayoría de las reacciones de enzimas de restricción son incubadas a 37 ° C durante
una hora, para luego analizar el DNA en otros tipos de reacciones, como por ejemplo, la
transformación bacteriana.
Figure: Cutting DNA with Restriction Enzymes
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/cutdna.html, Accessed: 6/26/13

22. Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es un procedimiento utilizado para separar moléculas a base de la
velocidad del movimiento a través de un gel en un campo eléctrico. En este procedimiento, la
dirección del movimiento es afectada por la carga de las moléculas y la velocidad de movimiento
es afectada por el tamaño y la forma, la fuerza del campo eléctrico, y la densidad del gel. Como
el DNA es una molécula con carga negativa, esta tendera a moverse en dirección hacia el polo
positivo del gel cuando se aplica una corriente eléctrica. Si el DNA es reducido en las enzimas de
restricción, los fragmentos van a migrar en distintos ritmos, siendo los fragmentos mas pequeños
los que se moverán con mayor rapidez y migraran más lejos durante el periodo de tiempo en el
que es aplicada una corriente eléctrica.

23. Diseño experimental II
Utilizando tres muestras de DNA obtenidas de un virus del bacteriófago lambda (λ). Estas
muestras serán una de DNA sin cortar, una con la enzima de restricción HINDIII, y una con
EcoRI. Con estas se procederá a separar fragmentos de DNA por electroforesis, teñir el DNA
para visualizarlo, y determinar el tamaño de los fragmentos formados en la digestión EcoRI.
Figure: Design of the Experiment II
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/design2.html, Accessed: 6/26/13

24. Procedimiento:
1. Preparación del Gel
Figure: Preparing the Gel
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/prepare.html, Accessed: 6/26/13
Luego de la preparación del gel, este será colocado en una cámara de electroforesis y cubierto, y
este será colocado en posición donde los pozos estén situados en el extremo del electrodo
negativo.
El aparato está listo para cargarse, pero en este aun no debe ser encendida la electricidad.

25. 2. Carga del Gel
Como el DNA no puede ser visto sin ser tenido (tintes especiales), se procede a añadir un tinte de
seguimiento para cada tubo de reacción. Recalcando que este tinte no manchara el DNA, sino
que las moléculas del colorante se moverán a una velocidad similar como la del DNA. También
se deberá añadir sacarosa o glicerol a la mezcla para que esta tenga la densidad necesaria que
permita hundirse en el pozo.
Nota: Se deben transferir cuidadosamente 5-10 µl de cada tubo de reacción en un pozo utilizando
una micropipeta.
Figure: Loading the Gel
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/loadgel.html, Accessed: 6/26/13

26. 3. Electroforesis
Se debe colocar la parte superior de la cámara de
electroforesis y conectar la cabrería eléctrica para el gel, y
de esta forma al encender la unidad de electroforesis, la
combinación de DNA/tinte de seguimiento comenzara a
moverse hacia el electrodo positivo.
Figure: Electrophoresis
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/electro.html, Accessed: 6/26/13

27. 4. Ejecución del Gel
Aunque el DNA no pueda verse a simple vista, el movimiento de este puede ser controlado
mediante el colorante de seguimiento, y la unidad deberá apagarse cuando este colorante se haya
movido hacia la parte final del gel.
5. Tinción de ADN y fotografía
Después de realizar la electroforesis, se procederá a manchar el DNA para poder visualizar este,
proceso en el cual se deberá sumergir el gel utilizado en azul de metileno para que este se una al
DNA. Luego se procederá a enjuagar varias veces el gel con agua, para eliminar el exceso del
colorante en el gel, y se observara que el DNA aparece como bandas azules que son visualmente
accesibles cuando la luz pasa a través del gel. Para terminar esta parte se procederá a fotografía
el gel para analizar este, y si no hay una cámara para fotografiar el gel, este debe ser envuelto en
una envoltura de plástico, en la cual utilizando un marcador se procederá a delinear los pozos y a
localizar las bandas azules.
Figure: Staining and Photographing the DNA
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/stainpho.html, Accessed: 6/26/13

29. Análisis de resultados II
Cada fragmento de DNA posee un numero particular de nucleótidos, y para determinar el tamaño
de los fragmentos de DNA producidos por enzimas de restricción particulares, realizan este
experimento utilizando fragmentos del DNA desconocido, y otros fragmentos de DNA conocidos
que actuaran como marcador. En el experimento anterior el marcador fue el DNA cortado con
HindIII, y utilizando este se puede proceder a determinar el tamaño de los fragmentos de la
digestión con EcoRI. Esto se puede realizar al medir la distancia de cada fragmento HindIII que
migraron en el gel, Mediante una curva estándar se determinaran el tamaño de los fragmentos de
la digestión EcoRI.
Figure: Making a Standard Curve
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/hindcurv.html, Accessed: 6/26/13

30. Quiz: evidencia

38. Figure: Lab Quiz II
Source: Pearson Education, Inc.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/quiz2.html, Accessed: 6/26/13

39. Resumen
La transformación genética son mutaciones que ocurren por una alteración en el que un
organismo huésped adquiere un DNA extraño y lo expresa como un gen extraño. Cuando ocurren
este tipo de mutaciones genéticas se producen cambios en interacción las células bacterianas, ya
sea en los requisitos que le permiten crecer o en los factores que le brindan resistencia ante
medicamentos. Un ejemplo de esto, es crecimiento de una célula (ej. E. coli) en un medio de
agar en el que antes de que ocurriera una mutación genética (E. coli con una adición de
plásmidos con ampR) esta tipo de medio la bacteria no crecía, y por tanto este factor de
crecimiento indica que la célula bacteriana adquirió a su vez, resistencia a tratamiento o
antibiótico con la que antes era tratada y eliminada. Mediante la electroforesis se pueden separar
moléculas a base del movimiento a través de un gel en un campo eléctrico. Esta moléculas de
DNA se combinan con un tinte de seguimiento, el cual permite distinguir los fragmentos de
DNA, para que después de teñir el gel con azul de metileno poder determinar los fragmentos del
DNA desconocido a partir de fragmentos de un DNA conocido (marcador), y se concluye que al
medir las distancias recorridas por los fragmentos en una curva estándar, y se puede obtener una
aproximación del tamaño del fragmento desconocido que deseamos determinar.

40. Referencias:
Knapp, T. Molecular Biology. Available: June 26, 2013.
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/intro.html