1. Aseguramiento de calidad
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Norma ISO 17025
Bqca. QM Alicia I. Cuesta,
Consultora Internacional de la FAO
2. Objetivos de la clase:
1. Preparación de medios de cultivo y reactivos.
2. Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes.
3. Evaluación de la calidad de los medios de cultivo:
Norma ISO/TS 11133-2:2000
3. REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea
apropiada
para los ensayos realizados.
Este es un punto crítico!
¿Cómo se asegura su calidad?
4. ¿Qué necesita un
microorganismo para crecer?
1. Medios de cultivo:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la
reproducción y la identificación de los microorganismos.
☺Contienen sustancias nutritivas
☺pH adecuado
☺Deben estar estériles.
2. Incubación:
Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.
☺La atmósfera empleada.(aerobio, microaerofílico,
anaerobio)
☺Tiempo.
☺Temperatura.
5. Medios de cultivos
Clasificación de medios de cultivo:
1.Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos.
2.Según su finalidad en microbiología:
No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar
el crecimiento de gran variedad de microorganismos.
Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de
microorganismo.
Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias
como ser sangre, suero, albúmina, etc... Para microorganismos exigentes.
Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer
diferencias entre diferentes tipos microorganismos.
6. Medios de cultivo
Los requerimientos de los
medios de cultivo son
específicos de :
la muestra que se analiza.
de los microorganismos a
ser detectados.
7. Los medios de cultivo se preparan:
1. En el laboratorio a partir de sus diferentes
componentes.
2. A partir de productos en polvo deshidratados
comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.
Se puede tomar como base el documento
ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding
stuff-General rules for microbiological examinations para:
-La preparación y esterilización de medios.
-Tiempos de almacenamiento recomendados.
8. Requisitos de los medio de cultivo
provistos por el fabricante :
Los lotes de medios deben estar debidamente
identificados.
Cada lote recibido debe ir acompañado de
evidencias del cumplimiento de las
especificaciones de calidad.
9. REQUISITO:
El fabricante
en el momento de la entrega
de medio de cultivo
debe proveer información
acerca de las
especificaciones de calidad,
como mínimo debe incluir lo
siguiente:
• Nombre del medio y lista de
componentes, incluido cualquier
suplemento.
• Fecha de vencimiento del medio.
• Condiciones de almacenamiento.
• Control de esterilidad.
• Control del crecimiento de los
microorganismos de interés
(target) y de los microorganismos
no deseados (no target) y criterios
de aceptabilidad.
• Controles físicos y criterios de
aceptabilidad aplicados.
• Fecha de emisión de las
especificaciones
10. Manejo de los medios de cultivo:
1. El laboratorio debe registrar la fecha :
de recepción
de apertura del envase.
de caducidad
2. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones apropiadas.
Envases: deben estar herméticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)
No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.
11. Control de calidad del agua destilada
Para la preparación de medios, soluciones y tampones,
debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles periódicos que aseguren su calidad.
Controles periódicos:
Requisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminación microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o
interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
12. Procedimiento para preparación de medios
de cultivo, diluyentes y reactivos
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben
prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con
un procedimiento documentado.
En dicho procedimiento debe haber una descripción del
equipamiento necesario.
El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la
identificación y otros datos en los medios de cultivo y
reactivos.
Debe haber un registro de preparación de medios de
cultivo y reactivos.
13. Almacenamiento de los
medios de cultivo y diluyentes
preparados:
Debe determinarse y verificarse
el período de validez de los medios preparados
en las condiciones de conservación especificadas.
En general los medios preparados se guardan:
En heladera no más de tres meses
A temperatura ambiente no más de un mes en condiciones
que impidan que su composición sea modificada.
Observar cambio del color, evaporación,
la deshidratación o el crecimiento microbiano.
14. REQUISITOS
Medios preparados por el laboratorio:
Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los
medios de cultivo y diluyentes preparados por el
laboratorio tengan las características adecuadas con
respecto a:
Recuperación o supervivencia de los microorganismos
de interés.(Productividad)
Inhibición o supresión de los microorganismos no
deseados.(Selectividad)
Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
Propiedades físicas (por ejemplo, pH, volumen).
Sea estéril.
15. Medio de cultivo:
Parámetros a tener en cuenta para
obtener un buen resultado.
Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser
inerte.
pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M
NaOH o 1M CLH
fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.
15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.
Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo
laminar.
Incubación: las pilas de platos < 6.
16. Medios listos para su uso:
Todos los medios y diluyentes que se suministren en
una forma directamente utilizable o parcialmente
completa deben ser validados antes de su utilización.
Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio
respecto a:
la recuperación o supervivencia de los microorganismos
de interés
la inhibición o supresión de los microorganismos no
deseados tiene que ser cuantitativa.
los atributos (por ejemplo: Propiedades físicas y
bioquímicas).
Parte de esa validación es provista por las
especificaciones de calidad del proveedor.
17. Reactivos
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.
Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioquímicas
Realizo controles positivo y negativo utilizando
microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas.
18. Control de las pérdidas de volumen
durante la esterilización:
Debe vveerriiffiiccaarrssee qquuee nnoo hhaayyaa ppéérrddiiddaass ssiiggnniiffiiccaattiivvaass ddee
vvoolluummeenn ddee llooss ddiilluuyyeenntteess dduurraannttee eell pprroocceessoo ddee
eesstteerriilliizzaacciióónn eenn aauuttooccllaavvee..
Este punto es especialmente importante en métodos
cuantitativos.
El laboratorio debe tener :
Un procedimiento documentado.
Registro de datos obtenidos realizados en forma
periódica.
El laboratorio determina el intervalo
en el que se efectúan estos controles.
19. Control de las pérdidas de volumen
durante la esterilización
Para la evaluación de la pérdida de volumen de los
diluyentes:
1. Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo
o frascos de dilución.
2. Medir el peso o volumen antes y después del proceso de
esterilización en autoclave.
3. Con los datos obtenidos, se efectúa el cálculo y la
inferencia estadística.
20. LAVADO DE MATERIAL:
Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto
lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un iinnssttrruuccttiivvoo para
esta tarea.
Pasos:
☺Descontaminación material de vidrio.
☺Enjuague y se lavado con agua caliente y extran
neutro (diluido al 2%)
☺Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un
nº de veces con agua destilada. Eliminar el detergente
☺El material se seca en estufa y se acondiciona para
ser esterilizado.
21. Eliminación de los reactivos:
Si bien la eliminación adecuada de los reactivos no es
un problema que afecte directamente a la calidad,
DEBE REALIZARSE DE ACUERDO CON LA
NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA DE MEDIO
AMBIENTE, SALUD Y SEGURIDAD.
Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo
sustancias tóxicas se especificarán claramente en cada
caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
22. Control ddee eesstteerriilliiddaadd
ddee llooss mmeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo yy ddiilluuyyeenntteess::
¿ Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios
de cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.
• La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba
se corresponden con las condiciones usadas durante el
ensayo.
• Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo
del comienzo y 1% de las placas o tubos del final de
verter o distribuir los medios o diluyentes.
• Este procedimiento se realiza por cada vez que se
esteriliza un lote de medio de cultivo o diluyente en
autoclave o se esteriliza por filtración.
23. REGISTRO
CONTROL DE
ESTERILIDAD DE
MEDIOS DE
CULTIVO Y
REACTIVOS
Datos a registrar:
Fecha de realización del control
Medio de cultivo o diluyente
Indicación del proceso de
esterilización (Ejemplo N º
correlativo de proceso en
autoclave o filtración)
Tiempo de incubación (en
horas)
Temperatura de incubación (º C)
Resultado
Conforme (SI o NO)
Firma del personal responsable de
la realización del control.
24. Síntesis parcial
En microbiología se le da especial énfasis a la calidad de los
medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada
para los ensayos realizados.
La preparación y esterilización constituyen pasos críticos en el
logro de este objetivo.
El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo
debe proveer información acerca de las especificaciones de
calidad.
El laboratorio debe contar con Procedimientos o Instructivos
documentados e implementado para :
La preparación y esterilización de medios de cultivo y
diluyentes
La preparación de reactivos
Control de calidad del agua destilada.
Lavado de material
Control de las pérdidas de volumen de los diluyentes durante
la esterilización en especial para métodos cuantitativos.
25. EVALUACIÓN DDEE LLAA CCAALLIIDDAADD
DDEE LLOOSS MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO::
El objetivo es definir la:
metodología para evaluar la
PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD
de medios de cultivo utilizados
en el laboratorio de microbiología.
26. PPRROODDUUCCTTIIVVIIDDAADD::
Definición:
rendimiento, recuperación, crecimiento
de un microorganismo que se espera que desarrolle en
el medio de cultivo.
Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como
por ejemplo el PCA se evalúa el adecuado desarrollo
de las cepas target o blanco.
En este caso se usan E. coli ATCC 25922,
S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633
27. SSeelleeccttiivviiddaadd::
Definición: la supresión del crecimiento de un
microorganismo que se espera sea inhibido en el
medio de cultivo.
Según el medio se usa una cepa apropiada de
referencia no-target para evaluar la selectividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo
Caldo Lauril sulfato (LST)
se evalúa el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son
E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864
y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Evalúa reacciones características: gas y turbidez.
28. En medios selectivos y/o diferenciales
hay que evaluar:
El crecimiento de las cepas target
Hay que prestar atención también a la apariencia,
tamaño y morfología de las colonias (especificidad)
El crecimiento de las cepas no-target debe estar en
parte o completamente inhibido.
29. PARA EVALUAR CADA LOTE DDEE MMEEDDIIOO DDEE CCUULLTTIIVVOO
sseeggúúnn NNoorrmmaa IISSOO//TTSS 1111113333--22::22000000
SSEE PPUUEEDDEE EEMMPPLLEEAARR LLOOSS SSIIGGUUIIEENNTTEESS MMÉÉTTOODDOOSS::
a)Pruebas cuantitativas
b) Pruebas semi-cuantitativas
c) Pruebas cualitativas
30. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
La elección del empleo de una u otra metodología
será considerada en cada caso en particular
según el medio a evaluar,
las capacidades y necesidades del laboratorio
ver ANEXO B norma ISO/TS 11133-2:2000.
31. MEDIO DDEE RREEFFEERREENNCCIIAA
El uso de un medio de referencia específico
es obligatorio en los métodos de cuantitativos
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas,
el uso de un medio específico de referencia
o un medio de cultivo que da una “la reacción positiva"
ayuda al ínterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad
(por ejemplo ser un medio listo para el uso
de calidad asegurada por el proveedor)
32. Cultivo de trabajo:
(según Instructivo de cultivos de referencia)
Se prepara un cultivo en fase estacionaria
de la cepa a partir de la cepa de reserva
almacenadas en el laboratorio
en un caldo no selectivo.
(por ejemplo caldo cerebro corazón)
33. Productividad:
Para evaluar la productividad de los medios de cultivo
sólido, semisólido o líquidos ya preparados esterilizados,
los mismos deben ser
inoculados con un microorganismo target apropiado o
cultivo de trabajo.
34. Productividad: Pruebas cuantitativas
Para las pruebas cuantitativas la proporción de
Productividad PR es definido como sigue:
PR = Ns /No
donde
Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio
de cultivo a probar (obtenido de uno o más placas)
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio
de cultivo de referencia definido obtenido de uno o más
placas que debe ser › 100 ufc.
35. Productividad: Pruebas cuantitativas
CRITERIO DE CONFORMIDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.
Allí figuran:
Los microorganismos
Tiempo y temperatura de incubación
Criterios
Medio de referencia que debe usarse según el medio
a evaluar.
PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que
el medio de cultivo sea conforme.
En general para que los medios no selectivos como
el PCA sea conforme, el PR debe ser › a 0,7.
36. Productividad:
Pruebas cuantitativas
Ejemplo
Se desea evaluar la productividad del PCA.
El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
1) Ns ( dil -6):140 ufc
No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme
2) Ns ( dil -6):100 ufc
No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.
37. Productividad: Pruebas semi-cuantitativas
en medios de cultivos sólidos
• Se inocula en forma de estrías
diluciones del cultivo con ansa
calibrada de acuerdo a la figura
o modelo.
• Las placas inoculadas se
incuban a temperatura y tiempo
que depende del medio de
cultivo evaluado y se observa el
crecimiento.
• Se evalúa la productividad del
medio teniendo en cuenta el
valor de cada estría con
crecimiento.
38. Productividad : Pruebas cualitativas
Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de
crecimiento.
Score para medios sólidos:
• 0 no hubo crecimiento
• 1 hubo crecimiento débil
• 2 hubo buen crecimiento.
Score para medios líquidos:
• 0 no hubo turbidez
• 1 hubo turbidez muy tenue
• 2 hubo buena turbidez
39. Selectividad:
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,
el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la
referencia se inoculan con un microorganismo y nivel
apropiado.
Se emplea una suspensión del microorganismo
de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se
inocula en la placa o en el tubo de medio.
43. REGISTRO
EVALUACION
DE MEDIOS
DE CULTIVO
La información a registrar es:
Medio de cultivo evaluado.
Nº ID o Nº lote de medio evaluado.
Fecha de realización del análisis.
Cepa usada (Género y especie del
microorganismo y tipo y Nº de
colección).
Medio de referencia usado para evaluar
la productividad.
Medio de referencia usado para evaluar
la Selectividad.
Resultado de productividad (unidades).
Resultado de selectividad (unidades).
Medio de cultivo conforme (SI/NO)
Personal responsable.
44. Aseguramiento de calidad de
los medios de cultivo
Posibles problemas
Anormalidad Posible causa
Falla en la
solidificación
del medio
sólido
Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
Peso incorrecto del agar
Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes
pH incorrecto Pobre calidad del agua.
Pobre calidad del medio deshidratado.
pH medido incorrectamente.
Contaminación externa con químicos.
Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
Color anormal Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
pH incorrecto
Contaminación externa.
Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.
45. Aseguramiento de calidad de
los medios de cultivo
Posibles problemas
Anormalidad Posible causa
Formación de
precipitado
Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
pH medido incorrectamente
Pobre calidad del agua.
Pobre calidad del medio deshidratado.
Medio inhibitorio/
Productividad
baja
Pobre calidad del agua.
Formulación inadecuada Ej.ingredientes y suplementos mal
pesados.
Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
Pobre calidad del medio deshidratado
Selectividad
pobre
Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
pH incorrecto.
Formulación inadecuada.
Pobre calidad del medio deshidratado.
Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio
demasiado caliente o en alta proporción.
46. Síntesis parcial
Los medios de cultivos sólidos, semisólidos y líquidos
empleados para la realizar el ensayo deben ser
evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y
reacciones características.
Para ello se han desarrollado pruebas cuantitativas,
semi-cuantitativas y cualitativas.
Las recomendaciones internacionales de organismos de
acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133-
2:2000.
Es importante el uso de cultivos de referencia con
adecuada trazabilidad.
47. Síntesis final
Un punto crítico a tener en cuenta a la hora de
implementar y la ISO 17025 y acreditar el laboratorio es la
preparación, esterilización y evaluación de la calidad de los
medios de cultivo empleados para realizar el ensayo.
Las recomendaciones internacionales de organismos de
acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133-1:2000 y
ISO/TS 11133-2:2000.
Esto implica una revisión de las prácticas cotidianas
realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que
los medios usados son adecuados a la finalidad prevista.
Notas del editor
Primero definimos de qué estamos hablando.
Además de la siembra en un medio de cultivo adecuado el microorganismo para desarrollarse necesita determinadas condiciones de incubación.
Según su estado físico: líquidos, semisólidos (contiene 0.5% de agar )y sólidos( contiene 2% de agar).Agar es una sustancia que se extrae de un alga que tiene la particularidad que permite la solidificación a T&lt; de 45ºC y a T&gt; de 45ºC es líquido.
Ejemplo: la muestra tiene una flora x, no es lo mismo una muestra estéril que una muestra con variada y alto número microbiano.
Tipo microorganismos: si lo que quiero detectar es microorganismos totales, el medio debe tener sólo la capacidad de soportar el crecimiento microbiano, si el ensayo es de coliformes ya deberá ser selectivo.
Ver evaluación de proveedores. Certificados por ISO 9000 es deseable
pH
Rango de tolerancia: 5,5 – 7,0
Determinación de conductividad:
Rango de tolerancia: ≤5 μS/cm a 25ºC
300000Ώcm
Recuento en placa:&lt;1000 ufc/ml
Cloro total residual &lt; límite de detección
Secado de placas en estufa entre 25 a 55 º C por 20 minutos.
Si las hay corregir. Poner diferente volumen inicial por ejemplo para obtener finalmente 9 ml.
Tenemos un medio preparado y estéril evaluamos su calidad.
Nº ID o Nº Lote del medio de cultivo: corresponde a un número que identifica un lote de medio de cultivo según el proceso de autoclave usado en la preparación en el laboratorio o un número provisto por el fabricante en el caso de medios ya listos para el uso.
Nº ID o Nº Lote del medio de cultivo: corresponde a un número que identifica un lote de medio de cultivo según el proceso de autoclave usado en la preparación en el laboratorio o un número provisto por el fabricante en el caso de medios ya listos para el uso.
Mañana veremos el laboratorio tiene un procedimiento para manejo y uso de cultivos de referencia
La superficie de las placas deben estar seca. Se chequea cada lote de medio preparado o listo para su uso. Se siembra en superficie.
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser › 100 ufc.
Para el caso no conforme veo qué pasó, evaluo la causa: pH, vencimiento del medio, proceso de esterilización.
Para las pruebas semi-cuantitativas y cualitativas se emplea un nivel de inóculo entre 10 ufc a 100 ufc por placa o tubo de medio.
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo el agar verde brillante se evalúa el adecuado desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son S. typhimurium ATCC 14028, S.entertidis ATCC 13076 y las cepas no target no evalúa. Evalúa
Caracteríticas diferenciales