Diagnostico de HIV

1. DIAGNOSTICO
INMUNOSEROLOGICO DE
INFECCION POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA

2. Virus de la Inmunodeficiencia Humana
(VIH)
Características:
• Virus ARN
• Familia: Retroviridae
• Tipos: VIH-1; VIH-2
• Ataca linfocitos CD4
• Presenta una transcriptasa
que permite la replicación
viral.
Estructura:

3. Evolución de la infección por Virus de
la Inmunodeficiencia Humana (VIH)
Fase inicial
• Relaciona dosis
infectante,
virulencia y
capacidad de
respuesta del
paciente.
Impera
Síndrome
Mononucleoso.
Puede pasar
asintomático.
Fase crónica
• Dura años con
multiplicación
viral de baja
intensidad. 1 de
cada 10,000
linfocitos CD4+,
está infectado.
Puede pasar
asintomática
apareciendo
poco a poco la
sintomatología
de infecciones
oportunistas.
Fase final
• Aumenta la
replicación del
virus y se
encuentra
infectada 1 de
cada 10
linfocitos, se
asocia con
estados
alterados e
infecciones
oportunistas
múltiples

4. Umbral de detección de anticuerpos
Umbral de detección de carga viral
Anticuerpos anti-VIH
Carga viral
Síntomas de infección primaria
Amplia diseminación en linfocitos
Infección
primaria
Latencia clínica
Síntomas
generales
Enfermedades
oportunistas
MUERTE

5. Criterios de infección o no por VIH
• Paciente infectado o seropositivo:
– con dos resultados de tamizaje positivos y prueba
suplementaria positiva.
• Paciente no infectado:
– paciente con una sola prueba de tamizaje positiva;
– dos pruebas de tamizaje positivas y suplementarias
negativas
• Paciente posiblemente infectado:
– dos pruebas de tamizaje positivos y prueba
suplementaria indeterminada

6. Paciente con factores de
riesgo para infección por VIH
Prueba rápida o
ELISA para VIH
Repetir prueba
Nueva
prueba
para VIH
Repetir pruebas en
tres meses o PCR
cualitativa
Considerar
repetir prueba
en tres meses
Realizar prueba
confirmatoria de
Western-Blot
Nueva
prueba
para VIH
Western-
Blot
PCR cualitativa para
VIH
Paciente sin
infección de
VIH
Nueva
prueba
para VIH
INFECCION
POR VIH
SI NO
NO
SI
SI
NO
ON
NO
SI
SI

7. ETAPA PRE-ANALITICA
laboratorio

8. BIOSEGURIDAD AL TOMAR MUESTRA
DE PACIENTE CON VIH
ASEPSIA
•USAR ISODINE
•EN ESPUMA
PUNCION
•CUBRIR LESION
CON ISODINE
•PUEDE HABER
REACCION
ALERGICA
TAPON DE
TUBOS
•LIMPIAR CON
ISODINE ANTES DE
CENTRIFUGAR

9. Inmunodiagnóstico, muestras
• El diagnóstico serológico se basa en la detección
de anticuerpos o antígenos del VIH.
• El diagnóstico se realiza en suero o plasma
obtenido de sangre periférica por venopunción.
• La muestra se debe conservar entre 2-8°C hasta la
llegada al Laboratorio.
• Se debe acompañar del formato único de envío
de muestras REMU-F-12
• La muestra debe etiquetarse con clave, no
nombre.

10. Pruebas de Laboratorio para detectar
el VIH
• Pruebas de tamizaje:
– para la detección de anticuerpos anti-VIH, en plasma
o suero sanguíneo. Incluyen ELISA y aglutinación
• Pruebas específicas:
– a las pruebas que determinan la presencia del virus o
algún componente del mismo
• Pruebas suplementarias:
– las que confirman la presencia de anticuerpos anti-
VIH en suero sanguíneo; Western blot;
inmunofluorescencia, radioinmuno-precipitación
(RIPA)

11. Métodos para diagnóstico de la
infección por VIH
ELISA en placa o
automatizada
(Quimioluminiscencia)
Inmunoelectrotransferencia
Western Blot
Inmunocromatografía, flujo
lateral
Dot ELISA
Aglutinación LIA

12. Evolución de las pruebas para la
detección de anticuerpos anti-VIH
• Primera generación: obtenidos de lisados
virales con posibilidad de falsos positivos.
Detección de anticuerpos entre 6 -8 semanas.
• Segunda generación: usan antígenos
recombinantes o péptidos sintéticos que
aumentan sensibilidad y especificidad.
• Tercer generación: emplean péptidos
sintéticos y proteínas recombinantes.
Detectan anticuerpos desde los 21-24 días

13. Evolución de las pruebas para la
detección de anticuerpos anti-VIH
• Cuarta y quinta generación: estas pruebas
detectan simultáneamente anticuerpos anti-
VIH-1 y/o anti-VIH-2 más antígeno p24 del
VIH reduciendo el tiempo de ventana entre 2
a cuatro semanas. Estas pruebas tienen una
sensibilidad y especificidad igual o mayor a
99%

14. ETAPA ANALITICA

15. Pruebas de Laboratorio para identificar
la evolución de la infección del VIH
Análisis Objetivo
Análisis de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA)
Pruebas de escrutinio
Aglutinación con látex Pruebas de escrutinio
Pruebas rápidas de anticuerpos orales Pruebas de escrutinio
Western Blot, para anticuerpos Análisis para confirmación
Inmunofluorescencia Análisis para confirmación
RT-PCR ARN virión Detección del virus en sangre
RT-PCR en tiempo real Cuantificación del virus en sangre
ADN de cadena modificada Cuantificación del virus en sangre
Antígeno p24 Marcador precoz de la infección
Proporción de linfocitos T CD4:CD8 Marca relación con la evolución de la
enfermedad

16. Fundamento para las pruebas de
escrutinio
• En este modelo de pruebas, se usa un soporte plástico que contiene anticuerpos para
detectar la presencia del antígeno p-24 y; antígenos sintéticos de VIH-1, VIH-2, para
detectar anticuerpos así como un control que valida la prueba.
• El proceso de revelado es similar al ELISA, usando anticuerpos o antígenos sintéticos
marcados con enzimas y un revelador cromogénico, para revelar la reacción.
• 1. En una primer reacción, los anticuerpos anti-p-24 reaccionan con éste antígeno (si
se encuentra).
• 2. Al mismo tiempo los antígenos sintéticos reaccionan con los anticuerpos contra el
VIH (si se encuentran).
• 3. En un paso siguiente se lleva a reaccionar anticuerpos anti-p24e marcados con una
enzima
• 4. Al mismo tiempo reaccionan anticuerpos con un biolizadoe marcado enzima
• 5. Por último se activa la enzima haciéndolo reaccionar con un cromógeno revelador
que se puede observar como una mancha colorida.

17. Prueba de escrutinio para detectar
anticuerpos anti-VIH
Fundamento: Resultado:

18. Lecturas posibles de prueba de
escrutinio para detectar VIH
Control
Ag-p24
VIH-2
VIH-1
VALIDA
P-24
VALIDA
P-24 VIH-1
VALIDA
VIH.1
INVALIDA
VALIDA
P-24; VIH-2

19. Fundamentos de la prueba de Western
Blot
• Este modelo usa plantillas plásticas a las que se
les han fijado antígenos específicos de VIH.
• 1. Se toman 50 μl del suero de pacientes se hacen
reaccionar en medio líquido por medio de
corrimiento electroforético permitiendo
reaccionar antígeno-anticuerpo.
• 2. Se revela usando la técnica de ELISA o
anticuerpos marcados con partículas radiactivas
que revelan una placa fotográfica evidenciando la
reacción antígeno-anticuerpo.

20. Fundamento de la prueba de Western-
Blot
PROTEINAS SEPARACION DE LAS
PROTEINAS EN SDS
POLIACRILAMIDA
SE TRANSFIEREN
LAS PROTEINAS A
HOJA DE
POLIMERO POR
ELECTROFUSION
SE EXPONEN LAS
PROTEINAS DE LA
HOJA DE POLIMERO
AL SUERO DEL
PACIENTE QUE
CONTIENE
ANTICUERPOS
LOS ANTICUERPOS QUE
REACCIONARON SON
REVELADOS CON ANTI-
ANTICUERPOS
MARCADOS CON
ENZIMAS (ELISA)

21. Resultados del Western Blot en la
detección de anticuerpos ant-VIH
ELISA LIA

22. Resultados y reporte de Western Blot
• El reporte se realiza
considerando la
presencia de bandas de
anticuerpos que
reaccionan con los
antígenos del virus, al
menos tres.
• P-53
• P-24

23. Resultados de la prueba de Western-Blot, desde el
tiempo cero, para la infección del VIH

24. Criterios para la interpretación de la prueba de Western
Blot para la infección del VIH
Organización Criterio
ASTPHLD/CDC Cualquier par: p-24, gp-41 ó gp120-160
FDA Presencia de: p-24, p-31, y gp-41 ó gp-
120/160
Consorcio de retrovirus standarización
serología (CRSS)
Al menos dos bandas: p-24 o p-31 y gp-
41 o gp-120/160
Cruz Roja A. Tres bandas, una de cada producto del
genoma: env, gag y pol

25. Principales bandas del Western Blot en
el diagnóstico de la infección del VIH
DENOMINACION GEN NATURALEZA WESTERN BLOT
Gp-160 ENV Glicoproteína precursora de la gp-
110/120 y de la gp-41
Banda nítida
Gp-110/120 ENV Glicoproteína de envoltura Banda de
bordes difusos
P-68 POL Transcriptasa inversa Banda nítida
P-55 GAG Precursora de las proteínas internas Banda doble
P-52 POL Transcriptasa inversa Banda nítida
Gp-41 ENV Glicoproteína transmembrana Banda difusa
P-40 GAG Precursora de proteínas internas Banda nítida
P-24/25 GAG Proteína interna Banda nítida
P-18 GAG Proteína interna A veces banda
doble

26. Interpretación de la prueba de
Western Blot en la infección del VIH
Interpretacion Perfil
POSITIVO 2 ENV + GAG + POL
INDETERMINADO 1 ENV + GAG + POL
GAG + POL
GAG
POL
NEGATIVA BANDAS NO SIGNIFICATIVAS
NINGUNA BANDA

27. Fundamento para la citometría de
flujo
• La técnica de citometría de flujo se basa en el uso de
anticuerpos monoclonales marcados con sustancias que
con alguna fuente luminosa, se exciten y emitan una señal
luminosa que cubre varias gamas de color.
• Los anticuerpos monoclonales, van dirigidos a diferentes
antígenos como CD4+; CD8+ que reaccionan con las
células que los tienen.
• Previamente se mezclan estos reactivos con las células
separadas y posteriormente se pasan por el equipo
detector de señal que los clasifica en base a su color de
señal, los separa y cuantifica, mostrando estos resultados
en una pantalla con gráficos para su identificación.

28. Fundamento de la citometría de flujo
Muestra de leucocitos marcados con anti-CD4, CD8 con colorantes fluorescentes
Cámara de flujo
Detector de
fluorescencia Lámpara lasser
Linfocitos
clasificados,
separados,
cuantificados
Contenedor

29. Resultados de una
citometría de flujo para
identificar CD4 y CD8
CD8
CD4

30. FUNDAMENTOS PARA LA PRUEBA DE
REACCION DE LA CADENA DE
POLIMERASA (PCR)• Cuando se detectan ácidos nucleicos ADN o ARN en muestras de suero
de pacientes que se sospecha tienen un agente etiológico determinado
mediante la Reacción de la Cadena de Polimerasa, se aprovecha la
existencia en circulación de fracciones de los ácidos nucleicos del agente
para recrear éstos en grandes cantidades mediante su amplificación
hasta tener una cantidad de réplicas del procedimiento y posteriormente
cuantificarlas.
• 1. Se usa el suero del paciente que se mezcla con fracciones conocidas de
ácido nucleico del agente del que se sospecha, junto con una enzima taq-
polimerasa que amplificará la reacción, nucleótidos que conformarán las
nuevas cadenas repetitivas y todo ello en solución amortiguadora.
• 2. Se sube la temperatura del termociclador a 90°C con lo cual los ácidos
nucleicos del agente etiológico se desnatiralizan abriéndose y
permitiendo que la taq-polimerasa forme nuevos segmentos.
• 3. Se disminuye la temperatura a 70°C con lo cual se detiene el proceso y
se alinean las hebras del ácido nucleico cerrándose y se vuelve a repetir
el proceso, hasta lo programado.

31. REACCION DE LA CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
FUNDAMENTOS RESULTADO
Componentes de PCR Proceso PCR un paso
ADN
SUERO
PRIMARIO
S
NUCLEOTI
D
TAG
POLIME
BUFFER EPENDORF
DESNATURACION
ALINEACIO
N
ELONGACION
CICLO PCR
90°C
50°C
70°C
TERMOCICLADOR
NUCLEOTIDOS
ENLAC
ES
HIDRO
GENO
ADN MUESTRA
SERICA
ADN
PRIMARI
O
DESNATUR
ALIZACION
ALINEACIO
N
ELONGACIO
N

32. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LA
REACCION DE LA CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

33. Resultados de las pruebas de PCR y citometría de flujo
en el diagnóstico de la infección por VIH
PCR:
• Los resultados se expresan
en copias del virus.
• Los valores críticos son:
• ≥ 100,000 copias
Citometría de flujo:
• Los resultados se expresan
en linfocitos T CD4/μl
• Los valores críticos son:
• ≤ 200/μl.

34. ETAPA POST-ANALITICA

35. Interpretación de resultados
concluyentes
METODO RESULTADOS
Presuntiva 1 Reactiva Reactiva No Reactiva
Presuntiva 2 Reactiva Reactiva No Reactiva
Western Blot Positivo Indeterminado Negativo
Interpretación Positivo Indeterminado
(Repetir en tres
meses)
(Sin factores de
riesgo)

36. Interpretación de resultados con
factores de riesgo
METODO RESULTADOS
Presuntiva 1 No Reactiva Reactiva (revisar
factores de riesgo)
No Reactiva
Presuntiva 2 Reactiva (revisar
factores de riesgo)
No Reactiva Reactiva
Western Blot Indeterminado Indetermindo Negativo
Interpretación Indeterminado
(repetir en tres
meses)
Indetermnado
(repetir en tres
meses)
Indeterminado por
ELISA (Revisar
factores de riesgo;
repetir en tres
meses)

37. COMENTARIOS, ¿PREGUNTAS?
RAMON PERALTA ESCOBAR
nomarrabocse@hotmail.com