1. Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Bioanálisis Clínico
INTEGRANTES
Javiera Inostroza Zúñiga
Gustavo González Valenzuela

2.  Identificar las proteínas mas importantes en
la progresión del grado leve a grave de la
Hepatitis B

3.  VHB
 Problema mundial
 Enfermedad crónica
 Secuelas
 Cirrosis
 Carcinoma hepatocelular

4.  Potente inhibidor de las proteasas séricas
 70 variedades
 Expresión alta normal en tejidos
 Expresión baja patológica (HBCG y CH)
 Niveles séricos altos

5.  31 pacientes con HBC (13 leves y 18 graves)
 10 pacientes convalecientes de HBA
 18 pacientes con CH relacionado con VHB
 12 individuos sanos (controles negativos)

6. Exclusiones:
 Hepatitis C y D
 VIH-1 (+) pero VIH-2 (-)
 HBsAg (+)
 Otras enfermedades con daño hepático crónico

7.  Sangre venosa
 Centrifugación a 2000 g por 10 min
 Sobrenadante almacenado a -80 °C
 Albumina sérica e IgG fueron removidas
 Concentración proteica determinada por
método de Bradford

8. • Cultivo
• Electroforesis • Cosecha
• IEF • Transferencia • SDS-PAGE
• SDS-PAGE • Inmunotinción • WB
• Tinción • Autoradiografía
Cultivo
2-DE Western Blot
celular
PMF Microarray
de tejidos
• Digestión
• MALDI-TOF • Microcortes
• Análisis de datos • Inmunotinción

9.  Isoelectroenfoque (IEF)
 Electroforesis SDS-PAGE
 Tinción con nitrato de plata
 Desventaja
 Evidencia expresión y presencia
 No se puede dilucidar el origen

12.  Corte del gel
 Lavado y desteñido
 Deshidratación
 Secado
 Digestión
 Extracción de fragmentos

14.  MALDI-TOF

17.  Búsqueda en base de datos (NCBInr)
Parámetros de búsqueda
1. Rango de masa del péptido de 1000 a 3000 U
2. Se permiten modificaciones carbamidometil y oxidaciones
3. Se permite la pérdida de un sitio de clivaje
4. Precisión de masa de +/- 1U
5. Se establecen restricciones sobre las especies de Mus

18.  Criterios de identificación positiva
Criterios identificación (+)
1. Partidor MS consta de mínimo 4 péptidos
2. Péptidos encontrados coinciden por lo menos en 20%
con la secuencia de la proteína completa
3. 100 ppm o mejor (precisión de masa)

20. Anticuerpo
primario
Anticuerpo secundario

21.  Ac 1rio policlonal anti AAT humano de conejo
 Ac 2rio anti conejo con HRP
 Kit de detección ECL

22.  Localización de proteína encontrada

23. La evaluación de AAT fue basada en la tinción celular positiva
en una escala de 3 puntos: 0 para ausencia de tinción, +1 para
tinción moderada y +2 para altamente teñido.

24. Parámetros Características
Células Chang, HepG2, Huh7, BEL-7402,
Líneas celulares
SMMC-7721 y 2215
Medio DMEM
Suero fetal de Bovino 10% (v/v)
Suplementos
Antibióticos
37 °C
Incubación CO2
Atmósfera humidificada

25. Incubación Lisis celular Agitación
Fase de crecimiento Centrifugación
Cosecha con tripsinizacion
Sobrenadante
Tampón de carga
Se hierve por 10 min.

27.  2-DE asociado a PMF
 AAT alta en suero CH y HBG
 En suero: no se puede determinar origen AAT
 Discrepancia de expresión suero/tejidos