INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Y CITOMETRIA DE FLUJO
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Este documento presenta información sobre inmunodeficiencias primarias y el uso de citometría de flujo en su diagnóstico. Explica los componentes del sistema inmune, las inmunidades innata y adaptativa, y las subpoblaciones de células B. También describe cómo la citometría de flujo se puede utilizar para determinar la expresión de proteínas como BTK, evaluar la función de neutrófilos en CGD, y analizar las poblaciones linfocitarias en diferentes trastornos inmunológicos.
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INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Y CITOMETRIA DE FLUJO
- 1. Dr. EDGAR MATOS BENAVIDES MEDICO INMUNOLOGO PRESIDENTE DE SPI DIAGNOSTICO DE IDPs POR CITOMETRIA DE FLUJO ematben@hotmail.com
- 2. Inmunodeficiencias Primarias Las inmunodeficiencias son desórdenes que afectan algún componente importante en la respuesta inmunológica, provocando una respuesta inadecuada a infecciones por diversos microorganismos y susceptibilidad al desarrollo de neoplasias Sistema Inmune Inmunidad innata Inmunidad adquirida ematben@hotmail.com
- 3. Tres Niveles de Defensa Lisozima en secreciones Integridad de la piel Clearance ciliar y mucus de las vías respiratorias Presencia de comensales Ph bajo estómago Complemento Neutrófilo Células NK Células T Células B DC ematben@hotmail.com
- 4. INMUNIDAD INNATA INMUNIDAD ADAPTATIVA COMPARTIMIENTOS DEL SISTEMA INMUNE ematben@hotmail.com
- 5. SEÑALES DEE PELIGRO DE LAS INMUNODEFICENCIAS PRIMARIAS ematben@hotmail.com
- 6. Clasificación de IDPs ≅200 defectos genéticos asociados a IDP ematben@hotmail.com
- 8. PACIENTES REGISTRADOS POR PAIS MAYO 2015 ematben@hotmail.com
- 10. Que se necesita para establecer el diagnóstico de una IDP ematben@hotmail.com
- 11. Que se necesita para establecer el diagnóstico de una IDP CITOMETRO DE FLUJO SECUENCIADOR ematben@hotmail.com
- 13. CITOMETRIA DE FLUJO Es una poderosa tecnología para la caracterización y análisis de células. Mide y analiza simultáneamente Múltiples características físicas de las células, cuando estas se mueven en un flujo a través de un haz de luz. ematben@hotmail.com
- 20. CASO CLINICO • 14 Julio 2012 •Niño, 10 años • Infecciones recurrentes desde los 2 años de edad • 11 neumonías y 3 meningitis bacterianas • 2 Episodios de Otitis con tratamiento ATB ematben@hotmail.com
- 21. • IgG ↓, IgA ↓, IgM ↓ • Leucocito 9,800 cel /uL • Linfocitos 970 cel /uL Citometría de flujo ematben@hotmail.com
- 22. 10 -1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 -1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 -1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 -1 10 0 10 1 10 2 10 3 15.8% 0.39% Control Paciente CD20 Citometría de flujo ematben@hotmail.com
- 23. • IgG ↓, IgA ↓, IgM ↓ • Linfocitos B ↓ • ¿Diagnóstico? • Agammaglobulinemia ¿Ya tenemos el diagnóstico? Citometría de flujo CASO CLINICO ematben@hotmail.com
- 25. ¿Qué gen está fallando en nuestro paciente? ematben@hotmail.com
- 27. Diagnóstico: • Agammaglobulinemia por mutación en BTK ematben@hotmail.com
- 28. ¿El camino que tomamos para hacer el diagnóstico fue el más adecuado?ematben@hotmail.com
- 29. Detección de Btk por citometría de flujo •Diagnóstico de deficiencia de Btk • Menos costo que secuenciamiento genético • Más rápido •¿En qué células se hace el estudio? • Monocitos •¿Qué actitud tomar si se detectan valores normales de Btk en monocitos? • Secuenciamiento genético si hay alta sospecha • Puede haber proteína no funcionante ematben@hotmail.com
- 30. CELULAS B Son leucocitos de los cuales depende la inmunidad mediada por anticuerpos Constituyen 5 al 20% de los linfocitos totales en sangre periférica Dan origen a las células plasmáticas encargadas de secretar anticuerpos ematben@hotmail.com
- 31. DESARROLLO DE LA CÉLULA B. ematben@hotmail.com
- 32. 100 101 102 103 104 FL4-H 0 2000 4000 6000 #Cells 13.1 CD19 APC CD27 IgD CÉLULA B DE MEMORIA SIN CAMBIO DE ISOTIPO CÉLULA B DE MEMORIA CON CAMBIO DE ISOTIPO CÉLULA B VIRGEN CÉLULA B DE MEMORIA DOBLES NEGATIVAS SUBPOBLACIONES DE CELULAS B ematben@hotmail.com
- 35. DETERMINACION DE BTK POR CITOMETRIA DE FLIJO UAAI -INSN ematben@hotmail.com
- 36. BTK 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 PE-A 0 20 40 60 80 100 %ofMax 48.7 5.16 BTK 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 100 101 10 2 10 3 10 4 190612_ISO test.fcs…APC-A, SSC-A subset APC-A PE-A 0 1 990 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 100 101 10 2 10 3 10 4 190612_BTK eduardo.fcs…APC-A, SSC-A subset APC-A PE-A 0 94.4 5.610 TESTIGO CD14 CD14 GAMMA BTK ematben@hotmail.com
- 37. Células B transicionales: Niveles altos se han sido reportados en infección por VIH , la deficiencia BAFFR (Receptor del Factor de supervivencia de la células B). Plasmablastos: El aumento de números de plasmablastos se correlaciona con la actividad de la enfermedad en LES. Células B vírgenes: El aumento en el número de estas células se ven en algunas patologías es debido a una disminución de las células B de memoria (HiperIgM y ICV). Células B de memoria sin cambio de isotipo: La reducción se han descrito deficiencias tales como CD19, CD81 , LRBA, la enfermedad linfoproliferativa LX. Células B de memoria con cambio de isotipo: Se han descrito en el síndrome de Wiskott-Aldrich , el síndrome linfoproliferativo LX, AID, UNG, CD40L, TACI así como algunos pacientes con ICV. Las células B dobles negativas: El aumento se han observado en LES, enfermedad infecciosa crónica (VIH, malaria) y en algunos pacientes con ICV. ematben@hotmail.com
- 38. • Niño, 3 años •Lesiones granulomatosas en piel desde los 7 meses de edad • Serratia, Proteus • 3 neumonías • BK Negativo ematben@hotmail.com
- 39. • IgG, IgA, IgM: normales • Poblaciones linfocitarias: normales • ¿Diagnóstico clínico? • Enfermedad granulomatosa crónica ¿Cómo confirmar el diagnóstico? ematben@hotmail.com
- 40. Oxigeno Molecular O2 Radical superóxido O2- H2O2 HOCl OH- Destrucción de Bacterias y hongos fagocitado ¿Qué gen está fallando en nuestro paciente? ematben@hotmail.com
- 42. ¿El camino que tomamos para hacer el diagnóstico fue el más adecuado? ematben@hotmail.com
- 43. RESULTADOS: PMN (Eventos contados) MFI Muestra basal: 5000 225 Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 29 955 Muestra con estimulo PMA: 5000 993 441 NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 33 Muestra Normal Epling, C. L., D. P. Stites, T. M. McHugh, H. O. Chong, L. L. Blackwood, and D. W. Wara. 1992. Neutrophil function screening in patients with chronic granulomatous disease by a flow cytometric method. Cytometry13:615–620. ematben@hotmail.com
- 44. PMN (Eventos contados) MFI Muestra Basal: 5000 1 151 Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 8 214 Muestra con estimulo PMA: 5000 11 827 NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 1.4 Muestra de Paciente con EGC Epling, C. L., D. P. Stites, T. M. McHugh, H. O. Chong, L. L. Blackwood, and D. W. Wara. 1992. Neutrophil function screening in patients with chronic granulomatous disease by a flow cytometric method. Cytometry13:615–620.ematben@hotmail.com
- 45. VALORES NORMALES • NOI > 30 De acuerdo con un estado normal, no consistente con el diagnostico de CGD. • NOI < 5 Consistente con el diagnostico de CGD. • NOI > 30 y NOI < 5 De acuerdo con un estado de portador de la ligada al cromosoma X forma de CGD en una mujer si hay 2 poblaciones claramente separadas de los granulocitos. ematben@hotmail.com
- 46. •En la actualidad hay más de 300 mutaciones descritas en el gen CYBB y se han registrado en la XCG Dbase (http://bioinf.uta.fi/CYBBbase). 2012 ematben@hotmail.com
- 47. 100 101 102 103 104 100 10 1 102 10 3 10 4 220213_iso pe.fcs…FITC-A, APC-A subset APC-A PE-A 0 0.078 99.90 ISO PERFORINA CD8 PERFORINA 100 101 102 103 104 100 10 1 102 10 3 10 4 220213_iso pe.fcs…FITC-A, SSC-A subset-1 PerCP-A PE-A 0.039 0.026 38.561.4 CD56 PERFORINA 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 104 220213_perforina 2.fcs…FITC-A, APC-A subset APC-A PE-A 0 12.8 87.20 CD8 PERFORINA 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 104 220213_perforina 2.fcs…FITC-A, SSC-A subset-1 PerCP-A PE-A 3.34 20.9 2055.8 CD56 PERFORINA PERFORINA DETERMINACION DE PERFORINAS POR CITOMETRIA DE FLUJO UAAI -INSN ematben@hotmail.com
- 48. 1er uso de citometría en IDP… • Determinación de poblaciones linfocitarias • Linfocitos B: CD19, CD20 • Naive • “Switched” memory • “Unswitched” memory • Transicionales, etc. • Linfocitos T: CD3, CD4, CD8 • Naive • Memory, etc • Linfocitos NK: CD16, CD56 ematben@hotmail.com
- 49. 1er uso de citometría en IDP… • Determinación de poblaciones linfocitarias • Linfocitos B: • Agammaglobulinemia • Inmunodeficiencia común variable • Linfocitos T: • Inmunodeficiencias combinadas: • T-B-NK- • T-B-NK+ • T-B+NK- • T- • Linfocitos NK: • Deficiencias NK ematben@hotmail.com
- 50. • Detección de expresión proteica (membrana, intracelular) • BTK: agammaglobulinemia ligada al X • WASP: síndrome de Wiskott-Aldrich • γC: X-SCID • SAP: síndrome linfoproliferativo ligado al X tipo 1 • CD40L: síndrome hiper-IgM • FOXP3: IPEX • IL12Rβ1: MSMD • CD18: LAD 1 • … 2do uso de citometría en IDP… PROBLEMA: disponibilidad ematben@hotmail.com
- 51. • Pruebas funcionales: • Estallido respiratorio: CGD • Fosforilación de proteínas intracelulares para evaluar señalización de receptores • Proliferación de linfocitos T en respuesta a mitógenos 3er uso de citometría en IDP… PROBLEMA: disponibilidad ematben@hotmail.com